ТЕСТ VOGES-PROSKAUER: ОСНОВА, ПІДГОТОВКА ТА ВИКОРИСТАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Тест Voges-Proskauer - це біохімічний тест, який використовується для виявлення бактерій, що належать до сімейства Enterobacteriaceae. Він особливо корисний для диференціювання штамів Escherichia coli від Klebsiella та Enterobacter, серед інших.

Випробування проводять у рідкому культуральному середовищі під назвою Methyl Red - Voges Proskauer, більш відомому за абревіатурою RM / VP. Це середовище складається з буферного поліпептону, глюкози, дифосфату калію та дистильованої води.

Комерційне середовище Methyl Red-Voges Proskauer (RM / VP) - тест позитивний та негативний відповідно. Джерело: Фото зроблено автором MSc. Marielsa Gil / Sudipta.nov15, з Вікісховища

Нинішня середовище RM / VP є модифікацією середовища Кларка та Лабса, яка спочатку містила меншу концентрацію пептонів та глюкози. Таким чином, було отримано менше іона водню, необхідного для позитивної реакції Вогеса-Проскауера.

Тест ґрунтується на здатності мікроорганізму використовувати глюкозу шляхом руху бутилен-гліколю та утворювати нейтральний кінцевий продукт, який називається ацетоїном, у присутності кисню та лужного рН.

У середовищі RM / VP, окрім того, що можна було виявити тест Вогеса-Проскауера, можна також виявити метиловий червоний тест.

Основа

Основа тесту Voges-Proskauer

Плюрипептони, присутні в середовищі, забезпечують необхідні харчові потреби для росту бактерій. Зі свого боку, глюкоза є основною сполукою. Багато бактерій мають здатність метаболізувати глюкозу та утворювати піровиноградну кислоту.

Піровиноградна кислота є середньою точкою метаболізму глюкози, і звідси кожен мікроорганізм може пройти різними шляхами. Деякі утворюватимуть змішані кислоти, такі як молочна кислота, оцтова кислота, мурашина кислота та янтарна кислота, а інші утворюють нейтральні продукти, такі як 2,3-бутандіол.

Тест Вогеса-Проскауера виявляє здатність мікроорганізму утворювати ацетилметил карбінол (ацетоїн), проміжний продукт 2,3-бутандіолу в аеробних умовах.

Ацетоїн знижується і утворює 2,3-бутандіол, але ця реакція є оборотною, тому якщо 2,3-бутандіол окислюється, утворюється ацетоїн. Тому кисень необхідний.

Фосфат двоталій - це буфер, який буферизує суміш при рН 6,9 ± 0,2.

Основи розкриття та тлумачення доказів

Для демонстрації реакції слід здійснити розробку за допомогою двох реагентів (реактиви Барріта), відомих як Voges A і Voges B.

Voges A - це 5% розчин α-нафтолу, а Voges B - 40% -ний препарат гідроксиду калію. Якщо гідроксид калію відсутній, його можна замінити на 40% гідроксиду натрію.

Α-Нафтол - каталізатор, який підвищить інтенсивність реакційного кольору, зробивши тест більш чутливим. Α-нафтол потрібно завжди додавати спочатку, струшуючи пробірку, щоб середовище контактувало з киснем. Таким чином присутній ацетоїн окислюється до діацетилу, а 2,3-бутандіол окислюється до утворення ацетоїну, передаючи його до діацетилу.

Ось так α-нафтол буде зв'язуватися з діацетилом, який, в свою чергу, приєднався до ядра гуанідину, присутнього в амінокислоті аргініну, останній походить від плюрипептонів.

Зі свого боку гідроксид калію або натрію відповідає за поглинання CO ₂ та реакцію з пептонами. Ця реакція викликає утворення лососево-рожевого кольору, добре видно після дуже струшування трубки.

Правильні кількості діацетилу, пептону та α-нафтолу повинні бути змішані, щоб колір миттєво відбувався. Якщо цього не відбувається, трубку дають відпочити протягом 15 хвилин перед перекладом.

Тест зазвичай позитивний через 2 - 5 хвилин, коли видно слабкий рожевий колір. Якщо залишити стояти 30 хвилин до 1 години, інтенсивність кольору буде максимальною (інтенсивний червоний).

Негативний тест з’явиться, коли бульйон жовтіє. Через 1 годину, якщо тест негативний, у результаті реакції гідроксиду калію на α-нафтол може утворюватися мідний колір.

Підготовка

Середній MR / VP

Зважте 17 г зневодненого культурального середовища та розчиніть у літрі дистильованої води. Дайте постояти 5 хвилин. Нагріти до кипіння, щоб повністю розчинитися. Подайте 3 - 4 мл у пробірки і стерилізуйте в автоклаві при 121 ° С протягом 15 хвилин.

Зневоднене культуральне середовище має бежевий колір, а підготовлене середовище має світло-бурштиновий колір.

Кінцевий pH середовища - 6,9 ± 0,2.

Вогес Реагент

Зважте 5 г α-нафтолу і розчиніть у 50 мл етилового спирту (абсолютний). Потім продовжуйте додавати етиловий спирт, поки він не досягне 100 мл.

Реагент Вогес Б

Відважте 40 г гідроксиду калію і розчиніть в стакані 50 мл дистильованої води. Склянку потрібно помістити на баню з холодною водою, щоб контролювати температуру, оскільки при розчиненні препарату температура різко підвищується.

Після того як розчин буде холодним, його переносять у мірну колбу і заливають до 100 мл дистильованою водою.

Процедура випробувань Voges-Proskauer

Для проведення тесту Вогеса-Проскауера, відвар з РМ / ВП прищеплюють досліджуваним мікроорганізмом з чистої культури протягом 18 - 24 годин.

Прищепка не повинна бути дуже щільною. Його інкубують при температурі 35-37 ° C протягом 24 - 48 годин, хоча інкубація протягом декількох днів іноді необхідна. Cowan and Steel вважають, що 5 днів - це мінімальний час інкубації, необхідний для виявлення всіх позитивних видів Voges-Proskauer (VP) родини Enterobacteriaceae.

Розробка тесту

Розділіть 1 мл аликвоти в пробірку і розробіть наступним чином: Помістіть 12 крапель (0,6 мл) реагенту Voges і 4 краплі (0,2 мл) Voges B. Змішайте для провітрювання і дайте відстоятися. за 5 - 10 хвилин до усного перекладу. Однак якщо тест все ще негативний, дайте йому сидіти і спостерігайте за трубкою через 30 хвилин до 1 години.

Поява рожево-червоного кольору свідчить про позитивну реакцію Вогеса-Проскауера. Якщо середовище залишається жовтим, реакція негативна.

Додавання розробників у вказаному порядку та кількості важливо, щоб уникнути помилкових негативів.

Використовуйте

Тест Фогеса-Проскауера корисний для розмежування між штамами кишкової палички, які є ВП негативними, із родів Klebsiella, Enterobacter, Serratia, серед інших, які є позитивними ВП.

Джерело: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. 5-е видання. Редакція Panamericana SA Аргентина.

QA

Контрольні штами можна використовувати для перевірки якості підготовленої середовища, включаючи Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium та Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Очікувані результати - позитивні реакції Вогеса-Проскауера лише для K. pneumoniae та E. cloacae. Решта дають негативні реакції.

Список літератури

1. Britannia Laboratories. MR-VP середній. 2015. Доступний за адресою: www.britanialab.com
2. Microkit Laboratories. M-Ident Voges Proskauer. 2014. Доступно: http://www.medioscultivo.com
3. Мак Фаддін Дж. (2003). Біохімічні тести для виявлення бактерій клінічного значення. 3-е вид. Редакція Panamericana. Буенос-Айрес. Аргентина.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Мікробіологічна діагностика Бейлі та Скотта. 12 ред. Редакція Panamericana SA Аргентина.
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. 5-е видання. Редакція Panamericana SA Аргентина.