ПЛЯМА ЗА ГРАМОМ: ОБГРУНТУВАННЯ, МАТЕРІАЛИ, ТЕХНІКА ТА ВИКОРИСТАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Граму є найпростішим і найбільш корисним Фарбування методом в діагностичної мікробіології. Ця методика була створена датським лікарем Гансом Крістіаном Грамом у 1884 р., Якому вдалося класифікувати бактерії як грампозитивні та грамнегативні відповідно до складу клітинної стінки.

Техніка зазнала певних модифікацій Геккером у 1921 р. Для стабілізації реагентів та поліпшення якості фарбування, тому пляма по Граму також відома як Грам-Хакер.

Різні мазки, пофарбовані плямою Грама. А. Грампозитивні коки. В. Грам-негативні стрижні. C. Грампозитивні, поліморфноядерні та одноядерні бацили. D. Дріжджі.

За допомогою цієї методики можна також спостерігати за формою мікроорганізмів, тобто якщо вони серед них є коки, бацили, кокобацили, плеоморфні, нитчасті. А також його розподіл у просторі: у скупченні, у ланцюзі, ізольовано, парами, у тетрадах тощо.

При підозрі на бактеріальну інфекцію більшість отриманих зразків слід намазати на предметне скло і пофарбувати Грам для мікроскопічного дослідження.

Звіт про Грам буде вказувати лікаря щодо того, який тип мікроорганізму може бути причиною інфекції, перш ніж отримати кінцевий результат культури.

У деяких випадках життя пацієнта дуже порушена, тому лікарям терміново потрібен звіт про Грам, щоб провести емпіричне лікування, поки вони чекають ідентифікації мікроорганізму.

Наприклад, якщо Грам виявить, що в спинномозковій рідині є грампозитивні коки, лікар проводить початкову терапію антибіотиками, які усувають цей тип бактерій, згідно з протоколами, встановленими для цього.

Після досягнення кінцевого результату з назвою виділеного мікроорганізму та відповідної антибіограми лікар оцінить, чи слід змінювати терапію чи ні. Це рішення буде прийнято відповідно до дослідження сприйнятливості мікроорганізму до антибіотиків, який він отримує, та еволюції пацієнта.

Основа

Це техніка, яка має 4 основні етапи: фарбування, фіксація морилкою, знебарвлення та контрфорса. Тому, крім забарвлення бактерій, ця методика також дозволяє їх диференціювати.

Кришталевий фіолетовий - це перший використаний барвник. Він має спорідненість до пептидоглікану і забарвлює всі присутні бактерії фіолетовий колір, згодом поміщається люголь, який виступає в якості бордюру, тобто сприятиме утворенню нерозчинних кристалічних фіолетово-йодних комплексів - рибоядерних білків всередині клітини. .

Грампозитивні бактерії, маючи товсту стінку пептидоглікана, утворюють більш складні комплекси (кристал-фіолетово-йод), тому вони зберігають барвник.

Крім того, це також впливає на те, що в стінці грампозитивних бактерій міститься більша кількість ненасичених кислот, які виявляють велику спорідненість до окислювачів (Люголь).

Тим часом грамнегативні бактерії мають тонкий шар пептидоглікану, через що бактерії утворюють менш комплекси, ніж позитивні по Грам.

Потім настає етап знебарвлення, де грампозитивні та грамнегативні бактерії поводяться по-різному.

Грамнегативні бактерії містять зовнішню мембрану, багату ліпополісахаридами, що є частиною їх клітинної стінки. Жири руйнуються при контакті з ацетоновим спиртом, тому зовнішня мембрана дестабілізується, вивільняючи фіолетовий кристал.

Ось як це протидіють сафраніну або базовому фуксину, перетворюючись у червоний колір.

Що стосується грампозитивних бактерій, вони протистоять в’яненню, оскільки відбілювач працює, закриваючи пори, запобігаючи витіканню кристало-фіолетового / йодного комплексу.

Тому забарвлення кришталевим фіолетовим залишається стабільним, і немає місця для сафраніну чи фуксину. Ось чому ці бактерії забарвлюються у синій або фіолетовий колір.

матеріали

Набір фарб Грама складається з:

• Фіолетове скло
• Люголь
• Ацетоновий спирт
• Сафранін або основний фуксин

Приготування барвників та реагентів

Кришталевий фіолетовий розчин

Рішення для:

Фіолетовий кристал ------------- 2 гр

Етиловий спирт 95% ----------- 20cc

Рішення B:

Оксалат амонію ----------- 0,8 гр

Дистильована вода ------------- 80 куб

Для остаточного приготування кришталевої фіалки розчин А повинен бути розведений 1:10 дистильованою водою і змішаний з 4 частинами розчину В. Суміш зберігають протягом 24 годин перед використанням. Фільтр в бурштинову пляшку, використовуючи фільтрувальний папір.

Суму, яку потрібно використовувати щодня, перекладають у флакон з бурштиновим бурштином.

Іодо-Люголь

Зважте та виміряйте вказану кількість кожної сполуки наступним чином:

Кристали йоду ------------- 1гр

Калій йодид ------------- 2гр

Дистильована вода ------------- 300 куб

Йодид калію потроху розчиняється у воді, після чого додається йод. Розчин струшують в бурштинову пляшку.

Суму, яку потрібно використовувати щодня, перекачують у меншу бурштинову пляшку з крапельницею.

Відбілювання

95% етиловий спирт -----------– 50 мл

Ацетон ------------------ 50 мл

Готується в рівних частинах. Добре накрийте кришкою, оскільки вона має тенденцію до випаровування.

Помістити в пляшку з крапельницею

Цей препарат забезпечує знебарвлення в помірний час 5-10 секунд і є найбільш рекомендованим.

Початківці вважають за краще вживати лише 95% етиловий спирт, де вицвітання відбувається повільніше, ніж 10 - 30 сек.

У той час як більш досвідчені можуть використовувати чистий ацетон, де знебарвлення відбувається дуже швидко від 1 до 5 сек.

Контрастність

Фондовий розчин Сафранину

Сафраніна -------------– 2,5 гр

Етиловий спирт 95% --------– 100 куб

Після зважування зазначеної кількості сафранину його розчиняють у 100 мл 95% етилового спирту.

Робочий розчин сафранину готують із вихідного розчину.

Для цього відміряйте 10 куб. См основного розчину, додайте 90 куб. См дистильованої води для отримання 100 мл.

Рекомендується переводити кількість, яку потрібно використовувати щодня, в бурштинову пляшку з крапельницею.

Мікроорганізми, які сильно забарвлюють грам-негативні плями по Граму-Хакеру, такі як певні анаероби, Legionella sp, Campylobacter sp та Brucella sp, можуть бути забарвлені набагато краще, використовуючи модифікацію Kopeloff плями на Грам-Хакера, називається плямою Грама-Копелофа.

Ця методика змінює сафраніновий барвник на основний фуксин. За допомогою цієї модифікації можна ефективно забарвити вищезгадані мікроорганізми.

Зберігання реагентів

Підготовлені барвники слід зберігати при кімнатній температурі.

Підготовка мазка зразка, що підлягає фарбуванню

Проба повинна містити щонайменше 10 ⁵ мікроорганізмів, перш ніж можливе спостереження за мікроорганізмом у мазку. Мазки можуть бути зроблені з прямого зразка або з культур у твердих або рідких середовищах.

Мазки повинні бути рівномірними, добре розподіленими та не надто густими, для кращої візуалізації наявних структур.

-Грама прямих зразків

Грам нецентрифікованої сечі

Сечу змішують і 10 мкл поміщають на предметне скло. Спостереження за принаймні однією бактерією / полем опускання свідчить про наявність інфекції.

Це означає, що культура матиме приблизно більше 100 000 КУО / мл (10 ⁵ КУО / мл) сечі у 85% випадків.

Цей метод не корисний для кількості колоній нижче 100 000 КУО.

CSF Gram

CSF слід центрифугувати, супернатант видалити, а гранули рознести на предметне скло. Ця рідина є стерильною при нормальних умовах; спостереження за бактеріями вказує на зараження.

Грам дихальних проб

Грамота мокротиння, бронхіальне чи бронхоальвеолярне промивання, хоча можуть бути різноманітні мікроорганізми, завжди керуватимуть діагнозом, окрім корисного типу клітин, що спостерігаються.

У випадку з мокротою мазок слід готувати з найбільш гнійними порціями зразка.

Грам табуретки

Не рекомендується виконувати грам на таких типах зразків, оскільки він не має діагностичного значення.

-Грама посівів

Їх можна зробити двома способами, один з рідких культур, а другий з твердих культур.

Рідкі культури

З рідких культур це надзвичайно просто; Кілька обсмажувань мутного бульйону беруть під конфорку і кладуть на чисту і суху гірку, роблячи кругові рухи від центру до периферії, щоб рівномірно розподілити матеріал.

Нехай спонтанно висохне на повітрі. Після висихання матеріал кріпиться до аркуша теплом. Для цього за допомогою пінцета лист пропускають 3 - 4 рази крізь полум'я пальника Бунзена, дбаючи про те, щоб не спалити матеріал.

Листу дають охолонути і поміщають на фарбувальний міст.

Солідні культури

Щоб зробити мазок на пляму Грама з твердої культури, виконайте наступне:

Перш ніж вибрати колонії, які потрібно взяти, слайд слід підготувати, помістивши приблизно дві краплі стерильного фізіологічного сольового розчину.

Якщо оригінальна культурна тарілка містить кілька різних типів колоній, для виконання грам буде обрана ізольована колонія кожної з них. Кожну колонію братимуть із платиновою петлею для розчинення у фізіологічному розчині, попередньо розміщеному на гірці.

Кругові рухи роблять від центру до периферії, щоб однорідно розподілити колонію на слайді.

Нехай спонтанно висохне на повітрі. Після висихання зафіксуйте аркуш теплом, як було пояснено раніше (розпалюючи слайд запальничкою), обережно не спалюючи матеріал.

Цю процедуру потрібно проводити для кожного колонії різного типу. На аркуші паперу слід зазначити порядок того, що спостерігається, наприклад:

Колонія 1: Бета-гемолітична жовта колонія: Грампозитивні коки спостерігались у скупченнях

Колонія 2: Колонія кремового кольору, без гемолізу: спостерігалися грамнегативні коккобацили.

Кожен слайд повинен бути маркований, щоб знати, що ми спостерігаємо.

Техніка

Техніка фарбування по Граму надзвичайно проста у виконанні та відносно недорога, і її не можна пропустити в лабораторії з мікробіології.

Робиться так:

1. Зафіксуйте мазок теплом і покладіть на фарбувальний міст.
2. Покрийте гірку повністю кришталевим фіолетовим протягом 1 хвилини.
3. Змийте водою Не сушіть
4. Лист накрийте розчином люголя, залиште діяти 1 хвилину. Змийте водою Не сушіть.
5. Відбілюйте протягом 5-10 секунд обережно струшуючи в спиртовому ацетоні. Або поставте аркуш у вертикальне положення і капніть краплі деколоризатора на поверхню, поки не буде видалено зайвий залишок фіолетового скла. Не перевищувати.
6. Змийте водою Не сушіть.
7. Замініть предметне скло на фарбувальний міст і на 30 секунд накрийте його сафраніном (Грам-Хакер) або 1 хв основним фуксином (Грам-Копелофф).
8. Вимийте водою
9. Нехай спонтанно висохне повітря у вертикальному положенні.

Після висихання помістіть 1 краплю зануреного масла, щоб спостерігати його під об'єктом 100X у світлому мікроскопі.

Корисність

Ця методика дозволяє розрізнити морфотинторіальні відмінності більшості бактерій.

Дріжджі також відрізняються цим забарвленням. Вони беруть кришталеву фіалку, тобто фарбують грам позитивом.

З іншого боку, можна виділити спороутворюючі грампозитивні бацили, в яких спостерігається чіткий простір всередині бацили, де утворився ендоспор, хоча спори не плямить добре. Інші методи, такі як Шеффер-Фултон, використовуються для фарбування спор.

Слід зазначити, що це фарбування не використовується для забарвлення всіх видів бактерій, тобто є випадки, коли фарбування не діє.

У цьому випадку можна згадати бактерії, яким не вистачає клітинної стінки. Наприклад: рід Mycoplasma, сферопласти, уреаплазма, L-форми та протопласти.

Він також забарвлює дуже погано бактерії зі стінками, багатими міколевими кислотами, такими як мікобактерії, та внутрішньоклітинними бактеріями, такими як хламідії та рикетсії.

Він також неефективний при фарбуванні більшості спірохетальних бактерій.

Є бактерії одного роду, які можна спостерігати в одному зразку, як грампозитивні та грамнегативні. Коли це трапляється, це називається змінною плямою по Граму, яка може бути пов'язана зі зміною поживних речовин, температурою, рН або концентрацією електроліту.

Поширені помилки

Перебільшене відбілювання

Перебільшення на етапі знебарвлення може призвести до спостереження за помилковими грамнегативними мікроорганізмами.

Не чекаючи достатньо довгого часу для висихання, щоб додати масло занурення

Це може призвести до того, що грампозитивні бактерії забарвлюють грамнегативні (помилкові грамонегативні). Це трапляється тому, що в старих культурах є ймовірно загиблі або зіпсовані бактерії, і в цих умовах бактерії не утримують фіалку кристала.

Використовуйте дуже старий розчин люголя:

З часом люголь втрачає свої властивості і колір в’яне. Якщо використовувати вже вироджений реагент, він не буде добре фіксувати кристалічну фіалку, тому існує можливість отримання візуалізації помилкових грамнегативних мікроорганізмів.

Блакитний фон

Правильно знебарвлений фон стане червоним. Синій фон вказує на те, що знебарвлення було недостатньо.

Список літератури

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Шерріс. Медична мікробіологія, 6-е видання McGraw-Hill, Нью-Йорк, США
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. (5-е видання). Аргентина, редакція Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Мікробіологічна діагностика Бейлі та Скотта. 12 ред. Аргентина. Редакція Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Загальна мікологія. 2-е видання Центрального університету Венесуели, бібліотечні видання. Каракас Венесуела.
5. "Грама пляма". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 4 жовтня 2018, 23:40 UTC. 9 грудня 2018, 17:11. Взято з es.wikipedia.org.
6. Гонсалес М, Гонсалес Н. 2011. Посібник з медичної мікробіології. 2-е видання, Венесуела: Дирекція засобів масової інформації та публікацій Університету Карабобо.
7. Лопес-Жакоме Л, Ернанде-Дуран М, Колін-Кастро С, Ортега-Пенья, Церон-Гонсалес Г, Франко-Кендеяс Ф. Основні плями в лабораторії мікробіології. Дослідження в інвалідності. 2014 рік; 3 (1): 10-18.