ФАРБУВАННЯ КІНЬЮНОМ: ОБГРУНТУВАННЯ ТА ТЕХНІКА - БІОЛОГІЯ - 2025

Фарбування Kinyoun є метод фарбування використовується для забарвлення бактерій і паразитів кислоти спиртостійка. Він народився від модифікації забарвлення Циель-Нельсена; Обидві методи інтерпретуються однаково, але відрізняються двома елементами: при приготуванні основного реагенту і тим, що методика Кіньюна не використовує тепло.

З цієї причини він також відомий як холодно модифікована пляма Зіель-Нельсена або Кіньюна. Показаний для фарбування Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, атипових мікобактерій, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris та Cyclosporas cayetanensis.

Cryptosporidium parvum, забарвлений плямою Kinyoun. Punlop Anusonpornperm, з Вікісховища

Варто відзначити, що Nocardia слабо піддаються фарбуванню за допомогою цієї методики, оскільки вони частково стійкі до кислото-спиртового, тому для цього роду існує модифікація методології.

У свою чергу, холодну техніку Кіньюна поєднували з методом трихрому, модифікованим Дідьє для виявлення кокцидії (Cryptosporidium parvum і Isospora belli) та спор мікроспоридії (Enterocytozoon bieneusi та Encephalitozoon intestinalis).

Основа

Основним фарбувальним реагентом є карболфухін або карбол фуксин, який має властивість зв'язуватися з карболовими кислотами в межах багатих ліпідів воскової клітинної стінки (міколевої кислоти) мікобактерій та деяких паразитів.

Цей зв’язок не протидіє кислотному відбілювачу; тому мікроорганізми визначаються як кислотостійкі.

На відміну від методики Зіеля-Нельсена, яка фіксує барвник за допомогою тепла, в техніці Кіньюна цей крок не є необхідним, оскільки карболічний розчин фуксину, приготовлений для цієї методики, містить високу концентрацію фенолу.

Фенол розчиняє ліпідний матеріал у клітинній стінці, дозволяючи ввести барвник карболфухін. Після проникнення барвника він залишається закріпленим, незважаючи на промивання кислотного спирту.

Таким чином кислотно-швидкі мікроорганізми набувають характерний червоний колір, тоді як все, що не є кислотним, стає знебарвленим і фарбується синім кольором.

Техніка

матеріали

- Модифікований карболовий фуксин.

- Спирт -кислота.

- Метиленовий синій.

Приготування фунзину Kinyoun carbol

- Базовий фуксин: 4 гр.

- Фенол: 8 мл.

- Спирт (95%): 20 мл.

- Дистильована вода: 100 мл.

Основний фуксин слід повільно розчиняти в спирті, постійно перемішуючи. Згодом кристалізований фенол розплавляють на водяній бані при 56 ° С. Після розчинення до розчину фуксину, приготованого вище, додають 8 мл.

Приготування кислотно-спиртового

- Концентрована соляна кислота: 3 мл.

- етанол (95%): 97 мл.

Він повинен бути виміряний, з'єднаний і змішаний.

Приготування контрастного барвника з метиленового синього

- метиленовий синій: 0,3 гр.

- Дистильована вода: 100 мл.

Його зважують і розчиняють.

Техніка фарбування кіньюном

1- Підготуйте мазок безпосередньо з зразка, який може бути мокротою, легеневою рідиною, осадом сечі, спинномозкової рідиною або калом, серед інших; або з суспензії мікроорганізмів, отриманих з чистих колоній, що розвинулися в середовищі первинної культури.

2- Зафіксуйте мазок теплом.

3- Помістіть мазок на містку для фарбування і накрийте підготовленим реагентом Kinyoun carbol fuchsin. Дайте йому відпочити 3 - 5 хвилин.

4- Вимийте дистильованою водою.

5- Відбілити кислим спиртом 3 хвилини і знову промити дистильованою водою.

6- Відбілюйте знову кислим спиртом протягом 1 або 2 хвилин, поки більше не забарвиться забарвлення.

7- Вимийте дистильованою водою і дайте стекти, поставивши гірку у вертикальне положення.

8- Покрийте препарат метиленовим синім і залиште діяти 4 хвилини.

9- Вимийте дистильованою водою і дайте висохнути на повітрі.

10 - Вивчіть при 40X, а потім у 100X.

Щоб покращити та прискорити фарбування кислотостійких мікроорганізмів, додайте 1 краплю змочуючого агента (наприклад, Тергітолу № 7) до 30-40 мл Kinyoun Carbol Fuchsin.

Деякі лабораторії змінюють контрастний барвник метиленово-синій на яскраво-зелений або пікринову кислоту; перший дає зелений колір фону, а другий створює жовтий колір.

Спеціальна техніка Кіньюна для нокардій

Для поліпшення фарбування бактерій роду Nocardia використовується модифікація плями Kinyoun. Методика така:

1- Накрийте мазок Kinyoun carbol fuchsin на 3 хвилини.

2- Вимити дистильованою водою.

3- Коротко знебарвити кислотний спирт, приготований на 3%, поки більше не забарвиться барвник.

4- Знову промийте дистильованою водою.

5- Покрийте препарат метиленовим синім і дайте йому діяти протягом 30 секунд.

6- Вимийте дистильованою водою і дайте висохнути на повітрі.

Комбінована технологія карбонового фуксину та трихрому, модифікована Дідьє

Цей метод рекомендується одночасно аналізувати зразки калу на кокцидії та спори Microsporidium sp. Процедура, яку слід дотримуватися, така:

1- Накрийте мазок кизином карболовим фуксином на 10 хвилин.

2- Видаліть барвник і промийте дистильованою водою.

3- Відбілюйте протягом 30 секунд спиртом соляної кислоти.

4- Знову промийте дистильованою водою.

5- Накрийте мазок розчином трихрому на 30 хвилин при 37 ° C.

6- Вимийте дистильованою водою.

7- Відбілити протягом 10 секунд спиртом оцтової кислоти.

8- Змийте мазок протягом 30 секунд, використовуючи 95% етанол.

QA

Як позитивний контроль, мазки з штамами Mycobacterium tuberculosis готують та фарбують реагентами, підготовленими для перевірки того, що бактерії набувають відповідного кольору (червоно-фуксія).

Негативні контролі також можна використовувати, якщо швидко готувати мазки з будь-яким штамом, крім кислотного спирту, таким чином перевіряючи, що весь зразок набуває контрастний колір.

Техніка Кіньюна порівняно з технікою Зіель-Нельсена

Техніка Кіньюна простіша, оскільки вона виключає ступінь нагріву, але головна її перевага полягає в тому, що вона дозволяє уникнути викиду парів, високотоксичних та ракових захворювань у довгостроковій перспективі. Тому пляма Kinyoun безпечніше для фарбування персоналу.

Важливо врахувати, що слід подбати про те, щоб реагенти не потрапляли в прямий контакт зі шкірою, оскільки вони є корозійними і хлорний вогник.

Щодо недоліків, негативний мазок не обов'язково вказує на відсутність організму. Крім того, наявність клітинного сміття може призвести до помилкових позитивних результатів, що призводить до плутанини в діагнозі.

Довідково

1. Прикладна клінічна хімія. (2016). BK Kinyoun Kit.Доступний за адресою: cromakit.es
2. Ороско-Ріко Мігель. Пляма Кіньюна та дві кокцидії при ВІЛ. Медичний журнал MD. 2011 р .; 3 (2): 137
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Мікробіологічна діагностика Бейлі та Скотта. 12 ред. Аргентина. Редакція Panamericana SA
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. (5-е видання). Аргентина, редакція Panamericana SA
5. Автори Вікіпедії "Пляма Кінюна". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. Вікіпедія, Вільна енциклопедія, 8 лютого 2018. Веб. 5 січня 2019 року.
6. Combol A, Fernández N, Figueredo E, Acuña A, Zanetta E. Впровадження методики фарбування для одночасного діагностування кокцидії та мікроспоридії. Інститут гігієни Університету Республіки. Монтевідео. Уругвай. Доступний за адресою: higie.edu.uy