ФОСФАТНИЙ БУФЕР (PBS): ОБГРУНТУВАННЯ, ПІДГОТОВКА ТА ВИКОРИСТАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Фосфатний буфер, фосфатний буферний сольовий розчин або БПС є буфер ізотонічного, функція якого є , щоб підтримувати рН і осмотичний тиск , як можна ближче до природної біологічної середовищі (фізіологічної). PBS в абревіатурі означає фосфатний сольовий розчин.

РН і осмолярність - це два дуже важливих аспекти, які необхідно контролювати в певних лабораторних протоколах. Що стосується рН, то важливо, щоб його контролювали, особливо в біохімічних реакціях, оскільки вони можуть змінюватися або не проводитися, якщо реагенти мають невідповідний pH.

Буферний фосфатний фосфат з двома різними рН. Джерело: Pixinio.com

Хоча контроль осмолярності є найважливішим, особливо при роботі з живими клітинами, оскільки плазматичні мембрани клітин реагують відповідно до концентрації розчинних речовин, у яких вони знаходяться.

Якщо клітини перенесуть у гіпертонічну середу, вони стануть зневодненими, оскільки градієнт води буде транспортуватися в ту сторону, де є більша концентрація розчинних речовин. Якщо, з іншого боку, клітини помістити в гіпотонічне середовище, клітини будуть поглинати рідину до тих пір, поки вони не лізуються.

Ось чому буфер PBS використовується для лабораторних протоколів, які потребують підтримання клітин in vitro, таким чином клітини не будуть пошкоджені.

PBS складається з комбінації солей, таких як хлорид натрію, фосфат натрію, хлорид калію та фосфат калію. Склад PBS може змінюватися в залежності від протоколу.

Основа

В основному функція фосфатного буфера полягає в підтримці постійного фізіологічного рН разом з концентрацією електроліту, аналогічною концентрації, виявленій всередині організму.

У цьому середовищі клітини здатні залишатися стабільними, оскільки фізіологічні умови максимально моделюються.

Інші сполуки можуть бути додані до початкової композиції PBS, якщо це необхідно, наприклад, додавання EDTA до буфера корисно для промивання еритроцитів у тесті на перехресну несумісність.

EDTA перешкоджає розщепленню та лизируванню до еритроцитів фракції комплементу C1, присутнього в сироватці крові, тобто дозволяє уникнути помилкових результатів несумісності. Крім того, EDTA допомагає дисоціювати клітини.

Підготовка

Кількість солей, яку необхідно зважити для приготування сольового розчину, забуференного фосфатом PBS, буде залежати від кількості, яку необхідно приготувати:

-Фосфатний буферний сольовий розчин (10X PBS)

На один літр розчину:

Зважити:

80,6 г NaCl,

2,2 г KCl,

11,5 г Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 г KH ₂ HPO ₄

Техніка підготовки

Помістіть важкі солі в стакан, додайте достатню кількість води (80%) і перемішайте на перемішувальній плиті з магнітною смужкою, поки солі не розчиняться.

Приготування PBS за допомогою перемішувальної пластини з магнітною смужкою. Джерело: Користувач: Ruhrfisch, Wikipedia. ком

Фільтр для видалення нерозчинених частинок. Використовуйте фільтри з порами 0,45 мкм. Автоклавуйте і розподіліть асептично в ламінарному витяжці в скляних банках з кришками.

Розчин 10х (концентрований) не регулює рН. Регулювання проводиться після розведення до концентрації буфера 1X PBS (розведення 1:10).

-Буферний фосфатний сольовий розчин (1X PBS)

1X PBS можна приготувати безпосередньо, зваживши відповідні кількості кожної солі, або можна приготувати шляхом розведення основного розчину (1:10) стерильною дистильованою водою.

-Для приготування безпосередньо одного літра фізіологічного розчину, забуференного фосфатом 1 PBS, зважте:

8,06 г NaCl,

0,22 г KCl,

1,15 г Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 г KH ₂ HPO ₄

Техніка підготовки

Продовжуйте, як пояснено в концентрованому розчині. Згодом рН необхідно відрегулювати. Для цього вимірюйте рН і залежно від результату використовуйте кислоту (HCl) або основу (NaOH) для зниження або підвищення pH відповідно до необхідності, поки він не стане 7,4.

Кислоту або основу додають по краплях, контролюючи значення pH розчину за допомогою pH-метра. Фільтр, автоклав і асептично розподіляють по конічних трубочках або банках за потребою.

-Приготувати 1X PBS з 10X вихідного розчину:

Зробіть розведення 1:10. Наприклад, для приготування 1 л 1х PBS відміряйте 100 мл вихідного розчину і додайте 700 мл стерильної дистильованої води. Відрегулюйте рН і залийте кількість води до 1000 мл.

Підготовлений буфер PBS безбарвний і прозорий.

Щодня PBS можна зберігати при кімнатній температурі, а решту в холодильнику.

Розчини для регулювання рН

HCl

На 100 мл 1 молярної HCL (соляна кислота).

Відміряйте 91 мл дистильованої води і помістіть її в 250 мл стакан.

Відміряйте 8,62 мл концентрованої HCl і повільно додайте її в склянку з водою (ніколи не робіть це навпаки). Вживайте відповідних заходів біобезпеки при поводженні з сильними кислотами (сильно корозійною речовиною).

Перемішуйте протягом 5 хвилин, бажано за допомогою перемішувальної тарілки з магнітною смужкою всередині склянки. Перенесіть у колбу об'ємом 100 мл і долийте до 100 мл дистильованою Н ₂ О.

NaOH

На 100 мл NaOH (гідроксиду натрію) 10 моль.

Відміряйте 40 мл дистильованої води і помістіть її в 250 мл стакан. Відміряють 40 г NaOH і додають у воду. Змішайте за допомогою перемішувальної пластини з магнітною смужкою всередині склянки.

Перенесіть в мірну колбу об'ємом 100 мл і доведіть до мітки дистильованою водою. Дотримуйтесь правил біобезпеки, оскільки ця реакція екзотермічна (вона виділяє енергію у вигляді тепла).

Якщо ви хочете приготувати інші кількості сольового розчину фосфату, ви можете ознайомитися з наступною таблицею:

Джерело: «Лабораторія вірусної та геноміки людини Медицинської школи UASLP»

Програми

В основному використовується в клітинній біології, імунології, імуногістохімії, бактеріології, вірусології та науково-дослідних лабораторіях.

Він ідеально підходить для промивання клітин центрифугуванням (еритроцитами), одношаровими промиваннями клітин, методами спектроскопічної еліпсометрії, кількісною оцінкою бактеріальної біоплівки, підтримкою клітинних культур вірусів, як миючий розчин в техніці непрямої імунофлуоресценції. і в техніках характеристики моноклональних антитіл.

Він також використовується для транспортування клітин або тканин, як розчинник для підрахунку клітин, приготування клітинних ферментів (трипсин), як розчинник для методу десикації біомолекул та для приготування інших реагентів.

З іншого боку, Мартін та ін. В 2006 р. Продемонстрували, що PBS корисний у криміналістичних лабораторіях, зокрема, для відновлення сперми з піхвових мазків або для відновлення клітин піхви з мазка пеніса. Таким чином можна встановити, якщо були статеві стосунки.

Обмеження

- Деякі буфери PBS містять в якості консерванту речовину, яку називають азидом натрію. Ця сполука може утворювати вибухонебезпечні речовини, якщо вона стикається зі свинцем або міддю. З цієї причини слід бути особливо обережним, якщо утилізувати цей реагент у стік. Якщо його відкинути таким чином, потрібно додати багато води, щоб розбавити її якомога більше.

-Цінк не слід додавати у фосфатний буфер, оскільки він спричиняє осад деяких солей.

-Ванген та його співробітники у 2018 році встановили, що використання PBS не підходить для промивання первинних клітин гострого мієлоїдного лейкемії (AML), витягнутих з периферичної крові, через те, що багато клітин втрачаються за рахунок лізису, при значному зменшенні матеріалу білка.

Тому вони визначили, що первинні клітини AML не слід промивати PBS після зберігання в рідкому азоті.

Список літератури

1. Coll J. (1993). Методи діагностики у вірусології. Ед Діас де Сантос. 360 пг
2. Родрігес М, Ортіз Т. Клітинна культура. Зміна середнього. Кафедра нормальної та патологічної цитології та гістологічного університету Севільського університету. Доступно на personal.us.es
3. Отримання фізіологічного розчину, забуференного фосфатом (PBS) (2008). Стандартні операційні процедури (SOPs) Лабораторія людини та вірусної геноміки UASLP School of Medicine. Доступно за адресою: genomica.uaslp.mx
4. "Фосфатний буферний сольовий розчин". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 3 квітня 2019, 19:36 UTC. 13 квітня 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Теми молекулярної біофізики. Доступно за адресою: users.df.uba.ar
6. Редіар. Посібник. PBS + EDTA. Доступно за адресою: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Використання забуференного фосфатом сольового розчину для відновлення клітин і сперматозоїдів з тампонів. Наукова справедливість. 2006 р .; 46 (3): 179–84. Доступно у: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A та ін. Метод консервації та промивання сольовим фосфатом сольового відмивання впливають на гострий мієлоїдний лейкоз. Int J Mol Sci. 2018 рік; 19 (1): 296. Доступно у: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Теоретичні та практичні основи гістохімії. Вища рада наукових досліджень. Мадрид. Доступно за адресою: books.google.co.ve