ЕНДОНУКЛЕАЗИ: ФУНКЦІЇ, ТИПИ ТА ПРИКЛАДИ - БІОЛОГІЯ - 2025

Ці ендонуклеази представляють собою ферменти , які розрізають фосфодіефірні зв'язку , розташовані в межах нуклеотидной ланцюга. Місця обмеження ендонуклеази дуже різноманітні. Деякі з цих ферментів розрізають ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота, наш генетичний матеріал) майже де завгодно, тобто вони неспецифічні.

На відміну від цього, існує ще одна група ендонуклеаз, які є дуже специфічними в області або послідовності, яку слід розщепити. Ця група ферментів відома як рестрикційні ферменти, і вони дуже корисні в молекулярній біології. У цій групі ми маємо відомі ферменти Bam HI, Eco RI та Alu I.

Ендонуклеази вирізають внутрішньо ДНК.
Джерело: pixabay.com

На противагу ендонуклеазам, існує інший тип каталітичних білків - екзонуклеази, які відповідають за розрив фосфодіефірних зв'язків у кінці ланцюга.

Обмеження ендонуклеаз

Рестрикційні ендонуклеази або рестрикційні ферменти - це каталітичні білки, які відповідають за розщеплення фосфодіефірних зв'язків всередині ланцюга ДНК у дуже специфічних послідовностях.

Ці ферменти можна придбати у багатьох біотехнологічних компаній, і їх використання майже важливо в сучасних методах маніпулювання ДНК.

Ендонуклеази рестрикції називаються за допомогою перших букв біноміального наукового найменування організму, з якого вони походять, а потім штаму (це необов'язково) і закінчується групою рестрикційних ферментів, до якої вони належать. Наприклад, Bam HI і Eco RI широко застосовують ендонуклеази.

Область ДНК, яку розпізнає фермент, називається місцем рестрикції і є унікальною для кожної ендонуклеази, хоча декілька ферментів можуть збігатися на місцях рестрикції. Цей сайт, як правило, складається з короткої паліндромної послідовності довжиною близько 4 - 6 пар основ, таких як AGCT (для Alu I) та GAATTC для Eco RI.

Паліндромні послідовності - це послідовності, які хоч і читаються у напрямку 5 'до 3' або 3 'до 5', однакові. Наприклад, у випадку з Eco RI паліндромною послідовністю є: GAATTC та CTTAAG.

Функції та застосування ендонуклеїв обмеження

На щастя для молекулярних біологів, бактерії в ході еволюції розробили ряд редукційних ендонуклеаз, які внутрішньо фрагментують генетичний матеріал.

У природі ці ферменти еволюціонували - імовірно - як бактеріальна система захисту від вторгнення чужорідних молекул ДНК, таких як фаги.

З метою розмежування нативного та чужорідного генетичного матеріалу ці рестрикційні ендонуклеази можуть розпізнавати специфічні нуклеотидні послідовності. Таким чином, ДНК, яка не має такої послідовності, може бути порушена всередині бактерій.

На відміну від цього, коли ендонуклеаза розпізнає сайт рестрикції, вона зв’язується з ДНК і розрізає її.

Біологи зацікавлені у вивченні генетичного матеріалу живих істот. Однак ДНК складається з кількох мільйонів пар основ у довжину. Ці молекули надзвичайно довгі і їх необхідно аналізувати невеликими фрагментами.

Для досягнення цієї мети рестрикційні ендонуклеази інтегруються в різні протоколи молекулярної біології. Наприклад, окремий ген може бути захоплений та тиражуваний для подальшого аналізу. Цей процес називається "клонування" гена.

Поліморфізм довжини фрагмента обмеження (RFLP)

Поліморфізми довжини рестриктазного фрагмента відносяться до структури специфічних нуклеотидних послідовностей у ДНК, які рестрикційні ендонуклеази здатні розпізнавати та вирізати.

Завдяки специфічності ферментів, кожен організм характеризується специфічною схемою різання в ДНК, породжуючи фрагменти різної довжини.

Види рестрикції ендонуклеаз

Історично ендонуклеази рестрикції класифікували на три типи ферментів, позначені римськими цифрами. Нещодавно був описаний четвертий тип ендонуклеази.

Тип I

Найважливіша характеристика ендонуклеаз I типу - це те, що вони є білками, що складаються з декількох субодиниць. Кожна з цих функцій є єдиним білковим комплексом і зазвичай має дві субодиниці, звані R, дві М і одну S.

S частина відповідає за розпізнавання сайту рестрикції в ДНК. R-субодиниця, зі свого боку, є важливою для розщеплення, а M відповідає за каталізацію реакції метилювання.

Існує чотири підкатегорії ферментів типу I, відомих літерами A, B, C і D, які є загальними. Ця класифікація заснована на генетичній комплементації.

Ферменти типу I були першими ендонуклеазами рестрикції, які були виявлені та очищені. Однак найбільш корисними в молекулярній біології є тип II, які будуть описані в наступному розділі.

Тип II

Ендонуклеази рестрикції типу II розпізнають специфічні послідовності ДНК та розщеплюють у постійному положенні, близькому до послідовності, яка виробляє 5 'фосфати та 3' гідроксили. Зазвичай вони потребують іонів магнію (Mg ²⁺ ) як кофактори , але є такі, які мають значно більш конкретні вимоги.

Структурно вони можуть виглядати як мономери, димери або навіть тетрамери. Рекомбінантна технологія використовує ендонуклеази типу II, і з цієї причини було охарактеризовано понад 3500 ферментів.

III тип

Ці ферментативні системи складаються з двох генів, названих mod і res, які кодують для субодиниць, які розпізнають ДНК, і для модифікацій або обмежень. Обидві субодиниці необхідні для обмеження, процес повністю залежить від гідролізу АТФ.

Для того, щоб розщепити молекулу ДНК, фермент повинен взаємодіяти з двома копіями послідовності непаліндромного розпізнавання, і ділянки повинні мати зворотну орієнтацію на субстраті. Розщепленню передує транслокація ДНК.

IV тип

Останнім часом була визначена додаткова група. Система складається з двох або більше генів, які кодують білки, які розщеплюють лише модифіковані послідовності ДНК, або метильованого, гідроксиметильованого, або гідрометильованого глюкозилу.

Наприклад, фермент EckKMcrBC розпізнає два динуклеотиди загальної форми RmC; пурин з подальшим метильованим цитозином, який можна розділити декількома парами основ - від 40 до майже 3000. Розщеплення відбувається приблизно на 30 пар основ після ділянки, яку розпізнає фермент.

Ендонуклеази типу V

Ендонуклеази цього типу також відомі як "самонавіюючі" ендонуклеази. Ці ферменти розпізнають і розрізають цільову послідовність ДНК на унікальних ділянках геному від 14 до 40 п.п.

Ці ферменти часто кодуються інтронами, і їхня функція, як вважається, сприяє горизонтальній передачі послідовностей зрізів. Після різання відбувається подрібнення подвійної спіралі ДНК на основі комплементарної послідовності.

Приклади

Ендонуклеаза I з кишкової палички діє як система захисту від фага та паразитів. Він розташований переважно між цитоплазматичною мембраною та клітинною стінкою. Він створює дволанцюгові розриви в сторонній ДНК, з якими вона взаємодіє в периплазматичному просторі.

Ендонуклеази CRISPR-Cas - це ферменти, які діють на захисний механізм багатьох видів бактерій. Вони ідентифікують та вирізають специфічні послідовності ДНК з організмів, що вторглись, які, як правило, є вірусами.

Нещодавно дослідники Массачусетського технологічного інституту (MIT) відкрили систему редагування геному CRISPR-Cas12bm з високою точністю для модифікації людських клітин.

Список літератури

1. Беррелл, ММ (Ред.). (1993). Ферменти молекулярної біології. Тотова, Нью-Джерсі: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Рестрикційні ферменти типу I та їх родичі. Дослідження нуклеїнових кислот, 42 (1), 20-44.
3. Мюррей, PR, Розенталь, штат Ксі, Пфаллер, МА (2017). Медична мікробіологія + StudentConsult на іспанській мові + StudentConsult. Науки про здоров’я Ельзев'є.
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Рестрикційна ендонуклеаза в аналізі та перебудові молекул ДНК. Щорічний огляд біохімії, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Ендонуклеази рестрикції типу II: структура та механізм. Науки про клітинне та молекулярне життя, 62 (6), 685.