ПЛЯМА РАЙТ: ОБГРУНТУВАННЯ, МАТЕРІАЛИ, ТЕХНІКА ТА ВИКОРИСТАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Райт пляма представляє собою метод фарбування , створений американським патологоанатом Джеймс Homer Райт в 1902 році, на основі барвника Романовського. Оскільки пляма Романовського було нестабільним, Райт включив метанол як розчинник та фіксатор.

Це забарвлення поліхроматичне, це означає, що воно генерує кілька кольорів залежно від структури, яка поглинає барвник. Ця методика фарбування широко застосовується для визначення диференційованих показників лейкоцитів та вивчення морфології еритроцитів, тромбоцитів та лейкоцитів у периферичній крові та кістковому мозку.

Різні мазки периферичної крові, забарвлені плямою Райт. A. Гострий лейкоз B. Плазмодій вівакс всередині еритроцита. C. Фальципарум плазмодію, макрогаметоцит. D. Лімфоцит

Його застосування є дуже важливим, оскільки порушення можуть спостерігатися в різних клітинних лініях крові, полегшуючи діагностику таких захворювань, як лейкемія або бактеріальні чи паразитарні інфекції.

Можливо, це найпоширеніші програми, в яких використовується ця методика, проте вони не єдині. Він також корисний для проб, окрім крові та кісткового мозку, таких як виділення з носа, фекальна слиз, мокрота, проби шкіри тощо.

Обґрунтування плями Райт

Пляма Райт народилася від плями Романовського, яка складається з метилового спиртового розчину кислого барвника (еозину Y) та основного барвника (метиленового синього) та продуктів їх окислення.

Суміш барвників, використовуваних у плямі Райт, викликає ефект, відомий як Романовський, тобто надає гарне фіолетове забарвлення ядрам лейкоцитів та нейтрофільних гранул, в той час як еритроцити плями рожеві.

Компоненти, відповідальні за надання типової кольорової гами плями Райт - це синій B та еозин Y. Ефект, що спостерігається, буде залежати від зв'язування барвників з хімічними структурами та взаємодії синього B та еозину Y.

Кислі структури, такі як нуклеїнові кислоти, ядерні білки та реактивна незріла цитоплазма деяких типів клітин, фіксують синій В (основне пляма).

Хоча основні структури, такі як гемоглобін, гранули сегментованих еозинофілів, серед інших клітинних структур, пов'язують еозин Y (кислотний барвник).

На результат фарбування можуть впливати різні фактори, такі як рН барвника Райт, буфер і промивний розчин; а також час фарбування та фіксації.

Отже, кожен крок у підготовці реагентів є вирішальним і повинен виконуватися з увагою до кожної деталі.

матеріали

Райт пляма. На 100 мл потрібно:

Відважте 0,3 г плями Райт, відміряйте 97 мл метанолу і 3 мл гліцерину.

Підготовка

У ступку помістіть велику кількість барвника Райта і поступово включайте гліцерин до повного розчинення порошку.

Згодом метанол додають, перемішують і переливають у бурштинову пляшку.

Перед використанням розчин слід струсити легкими рухами і процідити.

Буферний буферний розчин

В один літр дистильованої води додають 3,76 г гідрофосфату динатрію (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) плюс 2,1 г дигідрофосфату калію (KH ₂ PO ₄ ).

Дуже добре перемішайте, поки всі вбудовані реагенти не розчиняться. Відрегулюйте рН до 7,2. Перелити в скляну банку і тримати при кімнатній температурі.

Додаткові матеріали, необхідні для виконання фарбування

Крім того, потрібні інші матеріали, щоб мати можливість виконувати техніку фарбування, це: предметні гірки або кришки предметів, фарбувальний міст, футболки з водою або буфером для прання, таймер для збереження часу фарбування та деякий кількість сушильного матеріалу (всмоктуючий папір, марля або бавовна).

Компоненти плями Райт

Метанол

Спирт (метанол) служить фіксатором мазка крові до ковзання.

В основному це реагент, що відновлює коагулянт, зневоднює і фіксує. Тому його функція полягає в згортанні білків і робить їх нерозчинними, але фактично не денатурації їх.

Метанол є найбільш широко використовуваним реагентом для фіксації мазка у всіх лабораторіях, оскільки він дає кращі результати, ніж етанол. Ідеальна концентрація - 99%.

Заслінка

Буфер (буферний розчин) має функцію регулювання або підтримання рН барвника, оскільки pH, відрегульований до 7,2, є необхідним для здатності клітинних структур засвоювати барвники належним чином.

З іншого боку, етап фіксації метанолу зневоднює клітини, а буфер допомагає їх зволожувати.

Еозін (Y)

Еозин має спорідненість до будівельних блоків, оскільки це кислотний барвник. Відомо два типи еозину, дуже схожі між собою, настільки, що будь-який з двох можна використовувати, отримуючи однаковий результат.

Один називається еозином Y, жовтим еозином або тетрабромофлуоресцеїном, а інший називається еозином B, синюватим еритрозином B, або дибромодинітрофлуоресцеїном. Однак найчастіше використовується еозин Y.

Найважливішою властивістю цього барвника є його негативна полярність, завдяки чому він притягується до позитивно заряджених клітинних структур.

Метиленовий синій

Це основне забарвлення. Основна його властивість - метахромазія, тобто не всі структури будуть фарбуватися одним кольором, це залежить від хімічного складу структур, які забарвлюються.

Деякі з них стануть світлими або темно-синіми, а деякі - темно-фіолетовими або блідо-бузковими.

Техніка

1 - Виконайте розкидання зразка так, щоб на слайді або на покритті залишилася тонка плівка.

2-Дайте висохнути на повітрі приблизно 2 години.

3 - Помістіть сухий мазок на містку для фарбування або лоток для фарбування із поширенням зразка вгору.

4-Накрийте аркуш крапкою Райт по краплі до тих пір, поки не покриється вся поверхня. Залиште на 5 - 8 хвилин.

5 -Пляма повинна повністю покривати слайд, не розливаючись по краях. Якщо під час фарбування воно почне випаровуватися, додайте кілька додаткових крапель.

6-Згодом додайте рівну кількість амортизатора, трохи подуйте, поки не з’явиться характерний металевий блиск. Час від 10 до 15 хвилин.

7 Вимийте водопровідною водою, поставивши ніжний потік, поки аркуш не стане рожевим.

8 -З марлі, змоченої в спирті, видаліть барвник, приклеєний до тильної сторони гірки.

9 - Дайте мазку дуже добре висохнути перед тим, як помістити іммерсійне масло, щоб переглянути його під мікроскопом.

Корисність

Гематологія

Він ідеально підходить для фарбування мазків периферичної крові, для дослідження густих мазків крові та для дослідження клітин зразків кісткового мозку.

Завдяки хімічним властивостям цієї комбінації барвників структуру клітин можна легко розпізнати, а також можна виділити різні типи клітин.

Нежить

Ця методика дуже корисна для виявлення клітин носових виділень (епітеліальні клітини, сегментовані еозинофіли, поліморфноядерні клітини) при діагностиці алергічного риніту.

паразитологія

У цьому сенсі було корисним для дослідження Leishmania sp в межах гістіоцитів підшкірної клітковини при виразках шкіри. Так само його використовують для ідентифікації лейкоцитів у зразках калу (фекальна лейкограма).

У цьому випадку лікаря представляє інтерес дізнатися, чи є лейкоцитоз, присутній у стільці, поліморфноядерний чи одноядерний. Цей висновок фекальної лейкограми буде визначати, чи це відповідно бактеріальна чи вірусна інфекція.

З іншого боку, паразити, що циркулюють в крові, можна виявити всередині еритроциту або вільно в плазмі. Шукаються паразити - Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii та filarias, а у ветеринарії корисно шукати Theileria equi та Babesia caballi, збудників бебезіозу, особливо у коней.

Пляма Райт, а також пляма Giemsa дозволяють диференціювати гемопаразити від нормальних клітинних компонентів. Для цього можна використовувати два типи спредів:

Викладаємо тонкими

Кров розтікається у вигляді тонкої плівки на предметному слайді. Він забарвлений плямою Райт, розкриваючи характеристики ядра та цитоплазми.

Густа крапля

Ця методологія використовується для дослідження наявності паразитів у більшій кількості крові.

Для цього на гірку поміщається велика крапля крові. Потрапивши туди, його потрібно дефібрилювати, роблячи великі та великі кола від центру назовні, використовуючи край іншого слайда.

Нарешті, щоб можна було спостерігати паразитів у густому мазку, еритроцити потрібно лізірувати водою.

Дихальні інфекції

На респіраторному рівні ця методика також корисна, оскільки клітини, присутні в зразках мокротиння, промивання бронхів або бронхоальвеоляр, є важливими для встановлення діагнозу.

Аналогічно тут можна виділити поліморфноядерні клітини та мононуклеарні клітини.

Бактеріологія

Використання цієї методики в бактеріології обмежене, оскільки це не добре для фарбування бактерій, саме тому для їх фарбування використовуються інші спеціалізовані методи фарбування.

Однак він був використаний для пошуку епітеліальних клітин із включенням органів Chlamydia trachomatis в мазки слизової оболонки уретри або ендоцервикального каналу, хоча слід визнати, що це не найкращий метод для цього.

Також можна спостерігати спіралеподібні бактерії, такі як Borrelia burgdorferi, серед еритроцитів у інфікованих пацієнтів, а також морули або органи включення Ehrlichia sp в цитоплазмі лімфоцитів, моноцитів або нейтрофілів в мазку крові.

Мікологія

Гістоплазма капсулатум - патогенний грибок, який часто діагностується мікроскопічним спостереженням різних зразків тканин, забарвлених плямою Райт.

Як спостерігаються структури зразка крові з плямою Райт?

Джерело: Retamales E, Інститут громадського здоров'я Мазо В., Уряд Чилі. Рекомендації щодо фарбування мазків крові для читання гемограми.

Рекомендації щодо хорошого фарбування

Слайди для проби крові повинні спонтанно висохнути. Мазки повинні бути максимально тонкими, щоб отримати кращу фіксацію барвника та уникнути зайвого фарбування.

Для якісного фарбування доцільно фарбувати протягом двох годин після підготовки мазка. З іншого боку, ідеальним зразком є ​​капілярна кров, без антикоагулянта.

Однак якщо використовується венозна кров, її слід використовувати як антикоагулянтний ЕДТА, а не гепарин, оскільки останній може деформувати клітинні структури.

Щоб уникнути псування приготованого барвника, його слід зберігати в сухих місцях.

Під час процесу миття рекомендується використовувати воду, налаштовану на нейтральний pH.

Нарешті, доцільно періодично перевіряти методи фарбування, що використовуються в лабораторії.

Це робиться фарбуванням зразків або розширеними візерунками, як контроль якості. Цей крок є важливим, оскільки він забезпечує належну підготовку фарбування та час фарбування добре стандартизований.

Якщо аркуш шаблону погано пофарбований, то виникають проблеми, які необхідно вирішити.

Поширені помилки в фарбуванні Райт

Дуже бліде забарвлення

Дуже бліді мазки зазвичай обумовлені дуже коротким часом фарбування або надмірним миттям. Це виправляється шляхом подовження часу контакту з барвником або зменшення часу прання.

Барвні осади

Наявність осадів барвника в мазку може мати декілька причин, однак, найчастішими причинами є: використання нефільтрованого барвника, фарбування на нерівномірних плямах мостів, використання брудних пилом чи жиром листів, не миття добре повне фарбування.

Надзвичайно червоний або синій мазок

Буфер відповідає за рН барвника. Барвники з рН нижче зазначеного (кислого) призведе до дуже червонуватих мазків.

Якщо рН барвника вище (лужний), вийде надзвичайно синюватий мазок.

Режим зберігання

Реагент слід зберігати при кімнатній температурі.

Список літератури

1. Гутьеррес В. Порівняльне дослідження між методом фарбування Райт та тестом Елізи для діагностики собачого ерліхіозу в місті Сан-Педро-Сула, Гондурас. 2008. Дисертація на здобуття кваліфікації на ветеринарну медичну освіту. Університет Сан-Карлоса Гватемали.
2. Лопес-Жакоме Л, Ернанде-Дуран М, Колін-Кастро С, Ортега-Пенья, Церон-Гонсалес Г, Франко-Кендеяс Ф. Основні плями в лабораторії мікробіології. Дослідження в інвалідності. 2014 рік; 3 (1): 10-18.
3. "Райт пляма". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 18 травня 2018, 12:05 UTC. 8 грудня 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Частота Babesia spp. в мисливських конях, Кордова (Колумбія). Преподобний udcaactual diulg cient. 2013 рік; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Мікробіологічна діагностика Бейлі та Скотта. 12 ред. Аргентина. Редакція Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Інститут уряду охорони здоров'я Чилі. Рекомендації щодо фарбування мазків крові для читання гемограми.