МЮЛЛЕРОВИЙ ХІНТОНОВИЙ АГАР: ОСНОВА, ПІДГОТОВКА ТА ВИКОРИСТАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Мюллер - Хінтон Агар не є селективної, тверда живильним середовище складається з м'яса інфузії, пептони кислоти казеїну, крохмалю, агару і дистильованої воду. Це середовище забезпечує відмінний мікробний ріст більшості швидко зростаючих бактерій.

Спочатку він був створений Джоном Говардом Мюллером та Джейн Хінтон для виділення харчових вимогливих бактерій, таких як Neisseria gonorrhoeae та Neisseria meningitidis. Однак, завдяки своїм характеристикам, він виявився ідеальним для дослідження сприйнятливості до антибіотиків, забезпечуючи надійні та відтворювані результати.

Антибіограми (агар Мюллера Гінтона). Джерело: Д-р Грехем Бордс з en.wikipedia

Отже, агар Мюллера Хінтона - культуральне середовище, прийняте Інститутом клінічних та лабораторних стандартів (CLSI) та Європейським комітетом з тестування чутливості до антимікробних препаратів для проведення тесту на чутливість до антимікробних препаратів методом дифузії Кірбі та Бауер.

Основа

Будучи неселективним живильним середовищем, воно відмінно підходить для росту більшості патогенних бактерій.

З іншого боку, його простий склад робить речовини легко дифундують на ньому, будучи важливою характеристикою тесту на чутливість методом дискової дифузії.

Ще одна його характеристика полягає в тому, що він містить низьку кількість інгібіторів, що дозволяє ефективно оцінювати сульфонаміди, триметоприм та тетрацикліни.

Однак слід пам’ятати, що носій повинен відповідати певним умовам для забезпечення належного його функціонування, включаючи:

Регулювання рН, глибини агару та відповідної концентрації тиміну, тимідину, Са ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ та Zn ⁺⁺ .

Ви також повинні знати, що методологія стандартизована і тому всі параметри повинні бути виконані, такі як:

Концентрація прищепи, концентрація та збереження антибіотичних дисків, розміщення відповідної кількості дисків на агарі, відстань між одним диском та іншим, стратегічне розміщення певних антибіотиків, атмосфера, температура та час інкубація.

Підготовка

Зважте 37 г зневодненого середовища Мюллера Хінтона і розчиніть в 1 літрі дистильованої води. Нагрійте середовище, помішуючи, щоб сприяти розчиненню. Прокип’ятити 1 хвилину.

Автоклав стерилізують при 121 ° С протягом 15 хвилин. Виймаючи автоклав, колбу потрібно помістити на водяну баню при 50 ° С для охолодження. Налийте 25-30 мл у стерильну чашку Петрі діаметром 10 см.

Пластини повинні бути середньої товщини 4 мм (ідеально), при цьому допускається діапазон 3-5 мм.

Якщо бажано приготувати кров'яний агар, використовуючи аґер Мюллера Хінтона в якості основи, перед подачею на тарілки вилийте 5% стерильну і дефібриновану кров ягняти.

Кінцевий рН середовища повинен бути від 7,2 до 7,4.

Інвестуйте і зберігайте в холодильнику до використання. Перед використанням дозвольте плиті підійти до кімнатної температури.

Колір підготовленого середовища - світло-бежевий.

Програми

Застосовується для проведення тесту на чутливість до антибіограми або антибіотиків для найбільш швидко зростаючих не вимогливих збудників.

Якщо агар доповнений кров’ю, його використовують для проведення антибіограми вимогливих мікроорганізмів, таких як: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, серед інших. Він також використовувався для виділення пневмофіли Legionella.

Техніка антибіограми

Перед виконанням антибіограми необхідно приготувати бактеріальний розчин, еквівалентний 1,5 х 10 ⁸ клітин.

Для цього відбирають 3–4 колонії чистої культури і суспендують у бульйоні сої триптикази або в бульйоні Мюллера Хінтона, інкубують протягом 2 - 6 годин, а концентрацію регулюють стерильним сольовим розчином, порівнюючи його зі стандартом Mac Farland від 0,5%.

Якщо вони вимогливі до мікроорганізмів, колонії можуть бути суспендовані безпосередньо до концентрації 0,5% Mac Farland. Згодом на пластину Мюллера Гінтона засівають тампоном, просоченим приготованим бактеріальним розчином.

Для цього тампон занурюють у розчин, а потім зайву рідину видаляють натисканням на стінки пробірки. Відразу після цього тампон пропускають по всій поверхні, не залишаючи місця недоторканим, потім пластину злегка повертають і знову засівають. Операцію повторюють ще 2 рази.

Дайте постояти 10 хвилин, а потім вставити антибіотичні диски стерильними щипцями, залишивши між ними проміжок 24 мм. Поклавши кожен диск на агар, злегка натисніть на кожен диск щипцями, щоб переконатися, що вони добре прилягають.

Після закінчення процесу планшет перевертають та інкубують при 35-37 ° C в аеробіозі протягом 16-18 годин. Якщо це вимогливий мікроорганізм, він може заслужити мікроаерофілію, а якщо антибіограма містить оксацилінові диски, її слід прочитати через 24 години.

Для вимірювання діаметра кожного ореолу використовується лінійка. Результати слід записувати в мм. Згодом отримані значення співвідносяться з таблицями точок відсічення, опублікованими в поточному посібнику CLSI.

Вимірювання ореолу гальмування. Джерело: USCDCP, Pixnio.com

Повідомте як чутливий (S), проміжний (I) або стійкий (R), залежно від випадку.

Антибіотики підбираються відповідно до ізольованого мікроорганізму та типу інфекції, яку він виробляє.

Іноді слід пам’ятати про стратегічне призначення антибіотиків, щоб виявити фенотипічні закономірності резистентності.

Розміщення диска на агарі Мюллера Хінтона

Для ентеробактерій диск із клавулановою кислотою слід розміщувати проти цефалоспоринів 3-го та 4-го поколінь. Яйцеподібне розширення вказує на те, що штам є продуцентом бета-лактамаз розширеного спектру дії (ESBL). Це означає, що пацієнта не слід лікувати ніякими цефалоспоринами.

Фенотипічна експресія виробництва бета-лактамази розширеного спектру дії (ESBL) у штамі Escherichia coli. Джерело: Фото зроблено автором MSc. Маріельса гіл

При стафілококу важливо розмістити диск еритроміцину або азитроміцину перед диском кліндаміцину (D-тест).

Стійкий ореол в еритроміцині та сплощення в ореолі кліндаміцину вказує на те, що штам має стійкість до індукованої штамом кліндаміцину (ICR). Це означає, що лікування кліндаміцином не буде ефективним.

Для пошуку індуцибельних штамів AMP C у Enterobacteriaceae та деяких неферментуючих грамнегативні стрижні, диски тазобактена цефтазидиму, цефокситину чи піперациліну стикаються з диском іміпенему на відстані 27 мм.

Згладжений ореол в одному з дисків, що стикається з іміпенем, вказує на наявність індукованої AMP C.

Для пошуку конститутивного C-AMP 500-мкг клоксацилінового диска стикається з цефтазидимом (30 мкг) та цефотаксимом (30 мкг), на відстані 25 мм. Розширений ореол будь-якого з цефалоспоринів свідчить про позитивність.

Диск клоксациліну також можна замінити 9-міліметровим диском фільтрувального паперу Whatman № 6, просоченим фенілової борною кислотою (400 мкг) з відстані 18 мм. Він трактується так само, як і попередній.

Нарешті, для дослідження виробництва металобеталактамаз, особливо у Pseudomonas aeruginosa, використовується диск, просочений 10 мкл етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTA 750 мкг) та тіогліколевої кислоти (SMA 300 мкг), який стикається з іміпенем та меропенемними дисками на відстані 15 мм.

Тест є позитивним, якщо відбувається розширення ореолів іміпенему або меропенему до диска EDTA / SMA. Цей результат повинен бути підтверджений модифікованим тестом Ходжа.

Цей спосіб полягає в інокуляції штаму Escherichia coli ATCC 25922 на пластині Мюллера Хінтона. Іміпенемний диск розміщується в центрі пластини, після чого проводиться смуга від диска до периферії при підозрі на штам P. aeruginosa. На одну пластину можна перевірити до 4 штамів.

Тест буде позитивним, якщо навколо розтяжки є зона спотворення ореолу іміпенему.

Причини помилкових результатів

- Погано збережені диски антибіотиків можуть виробляти помилкову стійкість. Наприклад, оксациліновий диск дуже вразливий до перепадів температури.

-РН середовища, що нижче зазначеного (кислого), утворює менші ореоли в аміноглікозидах і макролідах (ризик помилкової резистентності), а більші ореоли в пеніциліні, тетрацикліні та новобіоцині (ризик помилкової чутливості).

-Якщо рН вище зазначеного (лужного), описані вище ефекти зворотні.

-Медіа з високими концентраціями тиміну та тимідину мають вплив, значно знижуючи ореоли гальмування сульфонамідів та триметоприму.

-Високі концентрації кальцію та магнію виробляють помилкову стійкість аміноглікозидів, поліміксину В та тетрациклінів проти штамів Pseudomonas aeruginosa.

-Низькі концентрації кальцію та магнію виробляють помилкову чутливість аміноглікозидів, поліміксину В та тетрациклінів проти штамів Pseudomonas aeruginosa.

-Наявність цинку впливає на результати карбапенемових дисків (іміпенему, меропенему та ертапенему).

-Товщина середовища нижче 3 мм дасть помилкові результати чутливості, тоді як товщина вище 5 створює помилковий опір.

-Мобілізація дисків в антибіограмі дасть деформовані ореоли, оскільки вивільнення антибіотиків негайно.

- Дуже слабкі прищепи впливають на результати, оскільки не буде рівномірного або злитого росту в агарі, необхідна умова для вимірювання ореолів гальмування, крім того, що ореоли можуть давати більше, ніж зазвичай.

-Позавантажена інокула може давати ореоли менше норми.

-Не дотримання відстані між дисками призводить до того, що один ореол перекривається іншим, і їх неможливо правильно прочитати.

-Інкубація з СО ₂ збільшує розмір ореолів тетрациклінових та метицилінових дисків.

-Інкубація при температурі нижче 35 ° С утворює більші ореоли.

-Добавка крові зменшує розмір ореолу сульфату.

Обмеження

Чутливість антибіотика, продемонстрована в антибіограмі проти мікроорганізму (in vitro), не є гарантією того, що він буде працювати in vivo.

QA

Щоб знати, чи містить середовище адекватну кількість тиміну, слід посадити штам Enterococcus faecalis ATCC 29212, а чутливість до триметоприму сульфаметоксазолу (SXT) слід перевірити, він повинен дати ореол, рівний або> 20 мм, щоб бути задовільним.

Список літератури

1. "Агар Мюллера-Гінтона". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 16 листопада 2018, 12:23 UTC. 27 січня 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Мікробіологічна діагностика Бейлі та Скотта. 12 ред. Редакція Panamericana SA Аргентина.
3. Кона Е. Умови для хорошого дослідження чутливості за допомогою тесту на дифузію агару. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Лабораторія Difco Francisco Soria Melguizo. Агар Мюллера Хінтона з 5% овечої крові. 2009. Доступний за адресою: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II Agar Laboratory. 2017. Доступний за адресою: .bd.com
6. Britannia Laboratories. Мюллер Хінтон-агар. 2015. Доступний за адресою: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. 5-е видання. Редакція Panamericana SA Аргентина.
8. Martínez-Rojas D. Беталактамази типу AmpC: Загальності та методи виявлення фенотипів. Преподобний соц. Мікробіол. 2009 р .; 29 (2): 78-83. Доступно за адресою: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Фенотипічне виявлення металобеталактаз в клінічних ізолятах Pseudomonas aeruginosa. Касмера, 2012; 40 (2): 113-121. Доступно за адресою: scielo.org.