ЦІГАРНИЙ АГАР: ОБГРУНТУВАННЯ, ПІДГОТОВКА ТА ВИКОРИСТАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Агар ТСИ або потрійний цукор железосодержащего агар являє собою твердий носій , який служить в біохімічному тест для керівництва первісної ідентифікації грамнегативних бацил. Він заснований на демонстрації ферментації присутніх цукрів та отримання сірководню та газу.

Склад і основа дуже схожі на тест заліза Клиглера, з тією різницею, що останній містить лише глюкозу та лактозу. Натомість, як випливає з назви, потрійний цукровий агар із заліза містить три ферментовані вуглеводи: глюкозу, лактозу та сахарозу.

Зображення тесту TSI з різними мікроорганізмами A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Джерело: Witmadrid, з Вікімедіа Commons

Крім того, середовище TSI має чотири похідні білка, які роблять його дуже поживним агаром: дріжджовий екстракт, м'ясний екстракт, пептон і протеозний пептон. Він також містить сульфат амонію чорного, тіосульфат натрію, хлорид натрію, фенол червоний та агар.

Нездатність мікроорганізму заквашувати глюкозу, присутню в середовищі, негайно виключає його з належності до родини Enterobacteriaceae. Отже, цей тест має важливе значення для вирішення, який шлях для визначення для визначення роду та виду.

Кожна лабораторія вирішує, чи працювати з агаром TSI або із залізним агаром Kligler.

Основа

Кожна з сполук виконує функцію в середовищі.

Хлорид натрію та агар

Хлорид натрію необхідний для підтримки осмотичного балансу середовища. При цьому агар дає тверду консистенцію.

Індикатор PH (фенол червоний)

РН підготовленої середовища збалансований у 7,3, а показник рН (феноловий червоний) стає жовтим нижче 6,8. Це означає, що невелика кількість кислот, що утворюються в результаті бродіння цукрів, перетворить середовище з червоно-оранжевого на жовтий.

Якщо ферментація не відбудеться, відбудеться лужність середовища за допомогою пептонів, перетворюючись з червоно-оранжевого в сильний червоний.

Білкові похідні (дріжджовий екстракт, м'ясний екстракт, пептон і протеозний пептон)

Коли бактерії метаболізують білки, присутні в агарі ТСІ, утворюються аміни, які підщеплюють середовище (переважно на рівні скосу), оскільки для реакції потрібен кисень. Аміни перетворюють ободок яскраво-червоним.

Але це буде залежати від здатності бактерій бродити вуглеводи чи ні.

Бродіння вуглеводів (глюкози, лактози та сахарози)

Вивчення бродіння цукрів може дати кілька зображень, і кожне трактується по-різному. Тестова інтерпретація поділяє мікроорганізми на 3 категорії: неферментатори глюкози, неферментогенні лактози та ферментатори лактози / сахарози.

Слід зазначити, що кількість глюкози в середовищі обмежена, тоді як концентрація лактози та сахарози в 10 разів більша.

Бактерії родини Enterobacteriaceae та інші мікроорганізми, що ферментують глюкозу, почнуть бродити цей цукор, оскільки він є найпростішим вуглеводом для отримання енергії.

З іншого боку, лактоза та сахароза - це складні вуглеводи, які необхідно розщеплювати та перетворювати на глюкозу, щоб вони могли вступити в цикл Емден-Мейєргофа.

-Мікроорганізми, які не ферментують глюкозу

Коли прищеплений мікроорганізм не зможе бродити глюкозу, набагато менше він зможе бродити інші вуглеводи. Тому тут не утворюються кислоти, але відбувається утворення амінів у скосі шляхом використання пептонів.

У цьому випадку ободок стає більш сильним червоним, і дно трубки може залишатися незмінним або він також може закиснути, залишивши всю трубку червоною.

Тлумачення: K / K означає лужне скошення / лужне або нейтральне дно

На зображенні на початку статті дивіться зображення трубки D.

Цей результат свідчить про те, що мікроорганізм не належить до родини Enterobacteriaceae.

-Мікроорганізми, які не ферментують лактозу / сахарозу

Якщо бактерії здатні ферментувати глюкозу, але не лактозу чи сахарозу, станеться наступне:

Бактерії споживають всю присутність глюкози приблизно через 6 - 8 годин, здатні підкислювати як скоси, так і блок; тобто агар буде повністю жовтіти. Але коли глюкоза виснажиться, а лактозу та сахарозу неможливо використовувати, бактерії почнуть метаболізм білків.

Ця реакція потребує кисню, тому на поверхні (скоси) відбувається деградація пептонів. Вироблені аміни алкалізують оболонку, перетворюючись з жовтого в червоний. Ця реакція засвідчується через 18-24 години інкубації.

Інтерпретація: K / A означає лужне скошення і кислий ват.

На зображенні на початку статті дивіться зображення трубки B.

Мікроорганізми, що ферментують лактозу / сахарозу

Мікроорганізми, здатні ферментувати лактозу та сахарозу, очевидно, можуть ферментувати глюкозу. Після того, як мінімальна кількість глюкози, присутньої в середовищі, витрачається, утворений піруват починає метаболізуватися, утворюючи кислоти через аеробний цикл Кребса, і в період від 8 до 12 годин все середовище стане жовтим.

Якщо бактерія здатна розщеплювати лактозу або сахарозу, кислоти продовжуватимуться вироблятися, і через 18 - 24 години вся трубка - скошеність і пробка - продовжить жовтіти.

Слід зазначити, що вживання глюкози здійснюється двома способами: один аеробним шляхом при скосі трубки, а інший анаеробно на дні трубки.

Інтерпретація: A / A означає кисле скошення / кислотне дно. Він може мати або не мати газу.

На зображенні на початку статті дивіться зображення трубки А.

Видобуток газу

Деякі мікроорганізми здатні виробляти газ під час бродіння цукрів. Газ засвідчується в трубці тиском, який він чинить у межах агару. Тиск викликає утворення бульбашок або зміщення агару. Іноді утворення газу може руйнувати середовище.

Важливо, що під час посіву середовища TSI прокол роблять чисто через центр агару, поки він не досягне дна. Якщо прокол буде відвернутий до стінок трубки, він може спричинити помилкові позитивні процеси у виробництві газу, оскільки він вийде через неправильно утворений канал.

Для видобутку газу, а також реакцій, що виникають у скосі агару, потрібен кисень, тому рекомендується трубу накрити ватною пробкою, а якщо використовується бакелітова кришка, вона не повинна бути повністю герметичною.

Видобуток газу повідомляється як позитивний (+) або негативний (-).

Закономірності газоутворення. Джерело: Схема, зроблена MSc. Маріельса Гіл. Джерело зображень: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe, через Wikimedia Commons

Тиосульфат натрію і сульфат амонію заліза

Бактерії, здатні виробляти сірководень (безбарвний газ), приймають сірку з тиосульфату натрію, присутнього в середовищі. Після утворення H ₂ S він вступає в реакцію з сульфатом амонію заліза, утворюючи сульфід заліза (добре видно чорний осад).

Виробництво H ₂ S повідомляється як позитивне (+) або негативне (-).

На зображенні на початку статті див. Зображення трубки С.

Підготовка

Зважте 62,5 г зневодненого потрійного цукрового заліза з агаром (TSI) і розчиніть в одному літрі дистильованої води.

Нагрівайте до повного розчинення агару. Варіть хвилину, часто помішуючи. Розподіліть 4 мл середовища в пробірки 13/100 з бавовняними кришками.

Стерилізуйте в автоклаві при 121 ° С протягом 15 хвилин. Вийміть з автоклава і дайте йому спочинути під кутом. Слід подбати про те, щоб і основа, і рамка мали однакову відстань.

Зберігати в холодильнику 2-8 ° C. Дайте прогрітися перед посівом штаму бактерій.

Колір зневодненого середовища світло-бежевий, а підготовлений засіб - червоно-оранжевий.

Кінцевий рН підготовленої середовища становить 7,3 ± 0,2.

Програми

Тест TSI широко застосовується на рівні лабораторії з мікробіології. Цей тест є важливим для орієнтації на тип тесту, який повинен бути застосований для ідентифікації роду та виду. Його хороше виконання та інтерпретація може заощадити матеріал та працю.

Якщо результатом є TSI K / K, а тест на цитохромоксидазу є позитивним, відомо, що тести повинні бути використані для ідентифікації неферментуючих грамнегативних стрижнів, таких як Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia, серед інших родів. Якщо вона є оксидазонегативною, вона орієнтується на пологи Acinetobacter, Stenotrophomonas тощо.

З іншого боку, якщо отримати TSI A / A або K / A і тест на цитохром оксидазу негативний, чим більше нітратів зводиться до нітритів, ми будемо впевнені, що це мікроорганізм, що належить до родини Enterobacteriaceae. У цьому випадку шлях ідентифікації буде зосереджений на конкретних тестах для цієї групи бактерій.

З іншого боку, якщо отримано зображення K / A або A / A і тест на цитохром оксидазу є позитивним, додаткові випробування, які слід зібрати, будуть спрямовані на ідентифікацію штамів бродіння, які не належать до родини Enterobacteriaceae, таких як: Aeromonas, Плесіомонас, Вібріо і Пастерелла.

ТСО із сірководнем, оксидазою негативною буде керувати ідентифікацією таких родів родини Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella або Salmonella.

ТСО з невеликим або помірним рівнем сірководню в лужному скосі з лужним фоном і позитивною оксидазою буде керувати використанням тестів для ідентифікації неферментуючих грамотрицательних стрижнів H ₂ S, таких як Shewanella putrefaciens.

Нарешті, TSI може бути використаний для дослідження виробництва сірководню в грампозитивних бацилах, особливо при підозрі на Erysipelothrix rhusiopathiae.

Посіяно

Середовище TSI повинно бути прищеплено чистими колоніями, виділеними в первинних або селективних культурах. Якщо колонія взята з селективних середовищ, які були посіяні зразками зі змішаною флорою, слід обережно брати лише з поверхні, оскільки життєздатні штами, інгібіровані в цій середовищі, можуть існувати в нижній частині колонії.

Тому петлю ніколи не слід охолоджувати на селективному середовищі, і тоді колонію приймають та прищеплюють середовищем TSI.

Посів буде здійснюватися прямою петлею або голкою. Буде зроблено прокол, дбаючи про те, щоб він проходив через центр середини до досягнення дна, а потім посів закінчується прищепленням поверхні до зигзагоподібної форми. Не робіть двох проколів.

Інкубують при 37 ° С в аеробіозі протягом 18-24 годин. Інтерпретувати в цей час, ні до, ні після.

Обмеження

Тест TSI слід прочитати протягом 18-24 годин після інкубації. Читання до цього часу може дати помилковий позитив для A / A бродіння. Тоді як читання після цього часу може призвести до помилкового негативного зображення неферментера через споживання пептонів, які алкалізують середовище.

Список літератури

1. Мак Фаддін Дж. (2003). Біохімічні тести для виявлення бактерій клінічного значення. 3-е вид. Редакція Panamericana. Буенос-Айрес. Аргентина.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Мікробіологічна діагностика Бейлі та Скотта. 12 ред. Редакція Panamericana SA Аргентина.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. 5-е видання. Редакція Panamericana SA Аргентина.
4. "Агар TSI." Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 10 липня 2018, 08:09 UTC. 10 лютого 2019, 03:33 Доступно за адресою: es.wikipedia.org
5. Britannia Laboratories. TSI Agar (потрійний цукровий агар з цукром). 2015. Доступний за адресою: britanialab.com
6. BD Laboratories. Потрійний цукровий агар із заліза (TSI Agar). 2003. Доступний за адресою: bd.com