ГІСТОХІМІЯ: ОБГРУНТУВАННЯ, ПЕРЕРОБКА, ФАРБУВАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Гістохімічний є корисним інструментом у вивченні морфології різних біологічних тканин (рослини і тварини) з - за його принцип реакції компонентів тканини , таких як вуглеводи, ліпіди і білки, в Зокрема, хімічні барвники.

Цей цінний засіб дозволяє виявити не тільки склад і структуру тканин і клітин, але і різні реакції, що в них відбуваються. Так само можливе пошкодження тканин, спричинене наявністю мікроорганізмів або інших патологій.

Гістохімічні плями. Вірус Нілу, грампозитивні та грамнегативні бактерії (грам), гістоплазми капсулатум (Grocott), мікобактерії туберкульозу (Ziehl Neelsen). Джерело: Pixinio.com/Wikipedia.org/Nephron / CDC / Dr. Георгій П. Кубіця

Гістохімія з минулих століть внесла важливі внески, такі як демонстрація існування гематоенцефалічного бар'єру Полом Ерліхом. Це стало можливим, оскільки мозок експериментальної тварини, яку використовував Ерліх, не був забарвлений аніліном, який є основним барвником.

Це призвело до використання різних барвників, таких як метиленовий синій та індофенол, для фарбування клітин різних типів. Цей висновок призвів до класифікації клітин на ацидофільні, базофільні та нейтрофільні відповідно до їх специфічного фарбування.

Останні дослідження застосували цю методику, щоб показати наявність різних сполук, у тому числі фенолів, а також вуглеводів та неструктурних ліпідів у тканинах виду Litsea glaucescens, більш відомого як лавр. Знайшовши їх, як у листі, так і в лісі.

Аналогічно, Colares et al, 2016, ідентифікували рослину, що представляє інтерес лікарської Tarenaya hassleriana, використовуючи гістохімічні методи. У цього виду було засвідчено наявність крохмалю, мірозину, а також фенольних та ліпофільних сполук.

Основа

Гістохімія заснована на фарбуванні клітинних структур або молекул, присутніх у тканинах, завдяки їх спорідненості із специфічними барвниками. Реакція забарвлення цих структур або молекул у їх первісному форматі пізніше візуалізується в оптичному мікроскопі або електронному мікроскопі.

Специфіка фарбування обумовлена ​​наявністю іоноприймаючих груп, присутніх у клітинах або молекулах тканин.

Нарешті, мета гістохімічних реакцій полягає в тому, щоб показати їх шляхом фарбування. Від найбільших біологічних структур до найменших тканин і клітин. Цього можна досягти завдяки тому, що барвники хімічно реагують з молекулами тканин, клітин або органел.

Звинувачення

Гістохімічна реакція може включати етапи перед виконанням методики, такі як фіксація, вбудовування та розрізання тканини. Тому слід враховувати, що на цих етапах ідентифікована структура може бути пошкоджена, що дасть помилкові негативні результати, навіть якщо вона є.

Незважаючи на це, попередня фіксація тканини, проведена належним чином, є важливою, оскільки вона запобігає автолізу або руйнуванню клітин. Для цього застосовуються хімічні реакції з органічними розчинниками, такими як: формальдегід або глутаральдегід, серед інших.

Включення тканини робиться так, щоб вона зберігала свою твердість при різанні і тим самим запобігала її деформації. Нарешті, розріз робиться мікротомом для дослідження зразків за допомогою оптичної мікроскопії.

Крім того, перш ніж приступити до гістохімічного фарбування, рекомендується включити зовнішній або внутрішній позитивний контроль у кожну партію тестів. А також використання специфічних барвників для досліджуваних конструкцій.

Гістохімічні плями

Від появи гістохімічних методик до сьогодення застосовується широкий спектр плям, серед яких найчастіше використовуються такі, як: Періодична кислота Шиффа (PAS), Грокотт, Зель-Нельсен та Грам.

Крім того, інші барвники використовуються рідше, наприклад, чорнило Індії, орцеїн або трихромна пляма Массона, серед інших.

Шифф періодичної кислоти (PAS)

При такому забарвленні можна спостерігати молекули з високим вмістом вуглеводів, такі як: глікоген і муцин. Однак він також корисний для ідентифікації мікроорганізмів, таких як гриби та паразити. Крім певних структур (базальна мембрана) в шкірі та інших тканинах.

Основою цього фарбування є те, що барвник окислює вуглецеві зв’язки між двома сусідніми гідроксильними групами. Це призводить до вивільнення альдегідної групи, і це виявляється реагентом Шиффа, виділяючи фіолетовий колір.

Реагент Шиффа складається з основного фуксину, метабісульфіту натрію та соляної кислоти, причому ці компоненти відповідають за фіолетове забарвлення при наявності альдегідних груп. Інакше утворюється безбарвна кислота.

Інтенсивність забарвлення буде залежати від кількості гідроксильних груп, присутніх у моносахаридах. Наприклад, у грибів, мембран фундаменту, муцинів та глікоген колір може переходити від червоного до фіолетового, тоді як ядра забарвлюються в синій колір.

Грокотт

Це одне з плям з найбільшою чутливістю при виявленні грибів у тканинах, вкладених парафіном. Це дозволяє ідентифікувати різні грибкові структури: гіфи, спори, ендоспори тощо. Тому вважається звичайною плямою для діагностики мікозу.

Він особливо застосовується при діагностиці легеневих мікозів, таких як пневмоцистоз та аспергільоз, спричинений деякими грибами з родів Pneumocystis та Aspergillus відповідно.

Цей розчин містить нітрат срібла та хромову кислоту, остання є фіксатором і барвником. Обґрунтування полягає в тому, що ця кислота виробляє окислення гідроксильних груп до альдегідів мукополяхаридами, присутніми в грибкових структурах, наприклад в клітинній стінці грибів.

Нарешті, срібло, присутнє в розчині, окислюється альдегідами, викликаючи чорне забарвлення, яке називається реакцією арґентафіну. Також можна використовувати контрастні барвники, такі як світло-зелений, і таким чином грибкові структури будуть спостерігатися чорного кольору зі світло-зеленим фоном.

Ziehl-Neelsen

Це фарбування ґрунтується на наявності кислотно-спиртової стійкості, частково або повністю, у деяких мікроорганізмах, таких як роди Nocardia, Legionella та Mycobacterium.

Використання цієї плями рекомендується, оскільки клітинна стінка згаданих раніше мікроорганізмів містить складні ліпіди, що перешкоджають проникненню барвників. Особливо в пробах із дихальних шляхів.

У ньому використовуються сильні барвники, такі як карболовий фуксин (основний барвник), і наноситься тепло, щоб мікроорганізм міг зберігати барвник і він не знебарвлюється кислотами та спиртами. Нарешті, розчин метиленового синього наноситься на забарвлення конструкцій, які знебарвилися.

Наявність кислотно-спиртової стійкості спостерігається в структурах, забарвлених червоним кольором, тоді як структури, які не чинять опір вицвітання, фарбуються синім кольором.

Грам і китайське чорнило

Грам - це дуже корисна пляма в діагностиці бактеріальних та грибкових інфекцій, серед інших. Це фарбування дозволяє розмежувати грампозитивні та грамнегативні мікроорганізми, чітко показуючи відмінності, що існують у складі клітинної стінки.

Тоді як чорнило Індії - це пляма, яке використовується для контрастування структур, що містять полісахариди (капсули). Це пов’язано з тим, що в навколишньому середовищі утворюється кільце, можливо, у Cryptococcus neoformans.

Орцеїн

При такому фарбуванні еластичні волокна та хромосоми різних клітин забарвлюються, що дозволяє оцінити процес дозрівання останніх. З цієї причини це було дуже корисно в цитогенетичних дослідженнях.

Це ґрунтується на поглинанні барвника негативним зарядом молекул, таких як ДНК, присутніх у ядрах найрізноманітніших клітин. Отже, це забарвлені в синій до темно-фіолетовий.

Трихром Массона

Ця пляма використовується для ідентифікації деяких мікроорганізмів або матеріалів, які містять меланічні пігменти. Це стосується мікозів, спричинених грибковими грибами, феогіфомікозом та еуміцетомою чорнозернистих.

Заключні думки

В останні роки було досягнуто значних успіхів у створенні нових методів діагностики, де гістохімія задіяна, але пов'язана з іншими основами або принципами. Ці методи мають інше призначення, як у випадку з імуногістохімією або ензимогістохімією.

Список літератури

1. Acuña U, Elguero J. Histoquímica. Ан. Хім. 2012 рік; 108 (2): 114-118. Доступно за адресою: are.iqm.csic.es
2. Местанца Р. Частота гістохімічних плям PAS, Grocott та Ziehl-Neelsen, що використовуються для ідентифікації мікроорганізмів, виконана в Патологічній службі анатомії Спеціалізованої лікарні Євгеніо Еспеджо у 2015 році. Центральний університет Еквадору, Кіто; 2016. Доступний за адресою: dspace.uce.edu
3. Tapia-Torres N, де-ла-Пас-Перес-Ольвера С, Роман-Герреро А, Кінтанар-Ісаїа А, Гарсія-Маркес Е, Крус-Соса Ф. Гістохімія, загальний вміст фенолу та антиоксидантна активність листя лісу та деревини ліцеї glaucescens Kunth (Lauraceae). Ліс і ліси. 2014 рік; 20 (3): 125-137. Доступно за адресою: redalyc.org
4. Colares, MN, Martínez-Alonso, S, Arambarri, AM. Анатомія та гістохімія Tarenaya hassleriana (Cleomaceae), виду лікарського інтересу. Латиноамериканський та Карибський вісник лікарських та ароматних рослин 2016; 15 (3): 182-191. Доступно за адресою: redalyc.org
5. Боніфаз А. Основна медична мікологія. 4-е видання. Мексика: McGraw-Hill Interamericana editores, SA de CV 2012.
6. Сільва Дієго Філіпе Безерра, Сантос Хеллен Бандейра де Понтес, Леон Хорхе Ескіче, Гомес Даліана Кейрога де Кастро, Алвес Поліанна Муніз, Нонака Кассіано, Франциско Вееге. Клініко-патологічний та імуногістохімічний аналіз веретеноклітинної плоскоклітинної карциноми мови: рідкісний випадок. Ейнштейн (Сан-Паулу) 2019; 17 (1): eRC4610. Доступно з: scielo.br