ФАРБУВАННЯ СПОРАМИ: ОБГРУНТУВАННЯ, МЕТОДИ ТА СПОСОБИ ВИКОРИСТАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Суперечка фарбування є методологією , використовуваною для фарбування опору структур , які утворюють деякі бактеріальних пологів , коли в несприятливих умовах; Ці структури відповідають формі виживання.

Є багато родів, які утворюють спори; однак основними з них є Бацил і Клостридій. Ці пологи вважаються більш актуальними, оскільки мають патогенні види для людини.

Фарбування спорами методом Шеффера - Фултона або Віртца-Конкліна. І тамбе (оригінальний завантажувач), від Wikimedia Commons

Кожна бацила може породити спору. Під час фарбування препарату спору можна виявити всередині бацили (ендоспора) або поза нею (екзоспора). При звичайних методах фарбування бактеріями - наприклад, по пляму Грам - спори залишаються безбарвними.

В даний час існує кілька методів фарбування, які здатні проникнути в товсту структуру спори для її фарбування. Ці методології дуже різноманітні; До них відносяться методика Дорнера, пляма Меллера та методологія Шеффера - Фултона, також відома як Віртц-Конклін.

З усіх згаданих методик методологія Шеффера-Фултона найбільш широко застосовується в звичайних лабораторіях. Він названий на честь двох мікробіологів, які створили забарвлення в 1930 році: Алісія Шеффер і Макдональд Фултон. Однак методику іноді називають Віртцем-Конкліном після двох бактеріологів з 1900-х років.

Основа

Спори не забарвлюються звичайними плямами, оскільки вони мають дуже товсту стінку. Складний склад спор перешкоджає потраплянню більшості барвників.

Якщо спору вивчають ззовні досередини, спостерігаються такі шари: спочатку є екзоспорій, який є найтоншим і зовнішнім шаром, утвореним глікопротеїнами.

Далі йде кутикула, яка забезпечує стійкість до високих температур, за ними йде кора, що складається з пептидоглікана. Пізніше - стіна основи, яка захищає протопласт.

Спора - це зневоднена структура, яка містить 15% кальцію та дипіколінової кислоти. Тому більшість технік фарбування спорами покладаються на застосування тепла, щоб барвник міг проникати в товсту структуру.

Після того, як спора забарвилася, барвник не може видалити. У техніці Шеффера - Фултона малахітовий зелений колір потрапляє у вегетативні клітини і при застосуванні тепла проникає в ендоспору, а також в екзоспори.

За допомогою промивання водою барвник видаляється з вегетативної клітини. Це відбувається через те, що малахітовий зелений барвник трохи основний, тому він слабко зв’язується з вегетативною клітиною.

Натомість він не може вийти зі спор і, зрештою, бацила протиставляється сафранину. Ця основа справедлива для решти методик, в яких відбувається щось подібне.

Техніка фарбування спорами

Для проведення фарбування спорами слід отримати чисту культуру підозрілого штаму, який слід вивчити.

Культуру піддають екстремальній температурі протягом 24 годин, щоб стимулювати мікроорганізм до спортування. Для цього культуру можна помістити в духовку при 44 ° C або в холодильник (8 ° C) на 24 або 48 годин.

Якщо залишити занадто довго при згаданих температурах, спостерігатимуться лише екзоспори, оскільки всі ендоспори вже вийшли з бацили.

Після закінчення часу на чисту гірку слід помістити кілька крапель стерильного фізіологічного розчину. Потім береться невелика порція культури і робиться дрібне розсипання.

Після цього його залишають висихати, фіксувати на спеці і фарбувати за допомогою однієї з методик, пояснених нижче:

Техніка Дорнера

1. Приготуйте у пробірці концентровану суспензію спірульованого мікроорганізму в дистильованій воді і додайте рівний об'єм відфільтрованого кинюна карболового фуксину.

2- Помістіть пробірку у ванну з окропом на 5 - 10 хвилин.

3- На чистому слайді змішайте краплю попередньої суспензії з краплею 10% -ного водного розчину нігрозину, кип'ятіть і відфільтруйте.

4- Розсипте і швидко просушіть на слабкому вогні.

5- Обстежуйте з метою 100X (занурення).

Спори забарвлюються в червоний колір і бактеріальні клітини виглядають майже безбарвними на темно-сірому тлі.

Модифікована техніка Дорнера

1- Суспензію спірульованого мікроорганізму розповсюджують на предметне скло і фіксують у теплі.

2- Зразок накривають смужкою з фільтрувального паперу, до якої додають карболовий фуксин. Барвник нагрівається на полум’ї Бунзенового пальника протягом 5–7 хвилин до утворення парів. Потім папір виймається.

3- Препарат промивають водою, а потім сушать вбираючим папером.

4- Покрийте мазок тонкою плівкою 10% нігрозину, використовуючи другий предметний слайд для поширення нігрозину або голки.

Забарвлення, сприйняте спорами та бактеріями, таке ж, як описане в рівні техніки.

Шеффер - техніка Фултона або Віртца-Конкліна

1- Зробіть тонкий мазок з суспензією спірульованого мікроорганізму на предметному горлі та закріпіть нагрівання.

2- Накрийте гірку 5% водним розчином малахітового зеленого кольору (на гірку можна помістити фільтрувальний папір).

3- Нагрійте над полум’ям пальника Бунзена, щоб викликати виділення пари та видалення полум'я. Повторіть операцію протягом 6 - 10 хвилин. Якщо під час процедури малахітовий зелений розчин випарується занадто багато, можна додати більше.

4- Вийміть фільтрувальний папір (якщо такий встановлений) і промийте водою.

5- Накрийте гірку 0,5% -ним водним сафраніном на 30 секунд (у деяких варіантах методики використовують 0,1% водний сафранин і залиште на 3 хвилини).

При цій техніці спори виявляються зеленими, а бацили червоними.

Недоліком є ​​те, що ендоспори молодих культур не забарвлюються добре, оскільки вони здаються надзвичайно чіткими або безбарвними. Щоб цього уникнути, рекомендується використовувати культури інкубації 48 годин.

Техніка Меллера

1- Накрийте мазок хлороформом на 2 хвилини.

2- Відмовтеся від хлороформу.

3- Покрийте 5% хромовою кислотою на 5 хвилин.

4- Вимийте дистильованою водою

5- Лист покритий карбоновим фуксином-фенікадою і піддається впливу полум'я пальника Бунзена до викиду парів; потім воно на кілька хвилин знімається з полум'я. Операція повторюється до 10 хвилин.

6- Вимийте водою.

7- Використовуйте підкислений етанол (соляний спирт) для знебарвлення. Залишається на 20 або 30 секунд.

8- Вимийте дистильованою водою.

9- Контрастируйте, накривши лист метиленовим синім протягом 5 хвилин.

10- Вимийте дистильованою водою.

11- Дайте висохнути, і зразок відбирають у мікроскоп.

Спори виглядають червоними, а бацили - синіми. Важливо не вдихати пари, оскільки вони токсичні і в перспективі можуть бути канцерогенними.

Модифікована техніка Меллера без тепла

У 2007 році Хаяма та його співробітники створили модифікацію методики Меллера. Вони усунули етап нагрівання барвника і замінили його, додавши 2 краплі ПАР Тергітол 7 на кожні 10 мл розчину карболу фуксин-карболу. Отримані такі ж результати.

Програми

Забарвлення спор дає дуже цінну та корисну інформацію для ідентифікації збудника, оскільки його наявність, його форма, розташування всередині бацили та здатність деформувати вегетативну клітину чи ні - це дані, які можуть керувати видом залучений у межах певного жанру.

У цьому контексті варто сказати, що спори можуть бути круглими або овальними, вони можуть розташовуватися в центрі, а також у парацентральному, піднебінному або кінцевому положенні.

Діаграма форми та положення ендоспор та екзоспор

Приклади

- Clostridium difficile утворює овальну спору в кінцевому положенні, яка деформує бацилу.

- Спора Clostridium tertium овальна, не деформує бацилу і розташована на кінцевому рівні.

- Ендоспора Clostridium tetani є термінальною і деформує бацилу, надаючи зовнішній вигляд барабанної палички.

- Спори Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy та C. septicum круглі або субтермінальні овальні та деформують бацилу.

- Ендоспора Clostridium sordelli розташована в центральному положенні, з невеликою деформацією.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. (5-е видання). Аргентина, редакція Panamericana SA

Список літератури

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Пропозиція спрощеної методики фарбування бактеріальних спор без застосування тепла - успішна модифікація методу Моллера. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Автори Вікіпедії Пляма Моллера. Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 3 листопада 2018 р., 03:28 UTC. Доступно за адресою: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Посібник з мікробіологічних методик. Кафедра основних наук Академія мікробіології. Національний політехнічний інститут.
4. "Ендоспора". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 25 лютого 2018, 10:20 UTC. 10 січня 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J та співробітники. (2006). Трудовий персонал автономної громади Естремадури. Конкретний порядок денний Том IV. Редакція MAD. Севілья-Іспанія, с. 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006), спеціаліст-лаборант, Галицька служба охорони здоров'я (SERGAS). Конкретний том теми порядку денного 2. Редакція MAD. Севілья-Іспанія, стор 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. (5-е видання). Аргентина, редакція Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Мікробіологічна діагностика Бейлі та Скотта. 12 ред. Аргентина. Редакція Panamericana SA