ЕНЗИМНА АКТИВНІСТЬ: ОДИНИЦЯ, ВИМІРЮВАННЯ, РЕГУЛЮВАННЯ ТА ФАКТОРИ - ХІМІЯ - 2025

Ферментативна активність є способом виразити кількість присутнього ферменту в даний момент часу. Позначає кількість субстрату, перетвореного в продукт, каталітичною дією ферменту за одиницю часу.

На нього впливають умови, в яких відбувається ферментативна реакція, саме тому вона зазвичай посилається на температуру, при якій її вимірюють. Але що таке ферменти? Вони є біологічними каталізаторами, здатними прискорювати швидкість реакції, не зазнаючи незворотних змін протягом каталізованого процесу.

Ананас або ананас, фрукти, які містять фермент бромелайн, і тому виявляють високу ферментативну активність Джерело: H. Zell

Ферменти, як правило, є білками, за винятком рибосом, молекул РНК з ферментативною активністю.

Ферменти збільшують швидкість реакції за рахунок зменшення енергетичного бар'єру (енергії активації); який повинен закінчитися, щоб досягти перехідного стану, і таким чином реакція відбудеться.

Молекули субстрату, які досягають перехідного стану, зазнають структурних змін, що призводять до того, що вони дають початок молекулам продукту. На основі функцій, які вони виконують, ферменти класифікуються на шість великих груп: оксиредуктази, трансферази, гідролази, ліази, ізомерази та лігази.

Ферменти бромелайн і папаїн, наприклад, є протеолітичними ферментами (гідролазами), які містяться в ананасі або ананасі, і папайї або папайї відповідно.

Відомо, що і ананас, і папайя полегшують процес травлення, оскільки, діючи протеолітичні ферменти, які вони містять, вони допомагають перетравлювати білки, тобто м'ясо та зерна.

Одиниця активності ферменту

Ферментна одиниця (МО) - це кількість ферменту, яка каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за одну хвилину.

Згодом Міжнародна система одиниць (СІ) визначила одиницю активності ферменту як кількість ферменту, що перетворює 1 моль субстрату в продукт в секунду. Ця одиниця отримала назву katal (kat).

1 моль = 10 ⁶ мкмоль і 1 хвилина = 60 секунд.

Тому 1 каталь дорівнює 60 · 10 ⁶ МО. Оскільки катал є великою одиницею, часто використовують менші одиниці, такі як: мікрокатал (µkat), 10 ^-6 катал і нанокатал (πkat), 10 ^-9 катал.

Специфічна діяльність

Це число одиниць активності ферменту, поділене на міліграми білка в досліджуваному зразку. Специфічна активність безпосередньо пов'язана зі ступенем очищення ферменту.

Як вимірюється активність ферментів?

Існує кілька методів визначення активності ферменту. Вибір конкретного методу буде залежати від мети аналізу ферментів; застосовність методу; доступ до обладнання, необхідного для проведення експерименту; витрати на використання певного методу тощо.

Існують спектрофотометричні, флуорометричні, хемілюмінесценційні, калориметричні, радіометричні та хроматографічні методи.

Спектрофотометричні методи можуть бути колориметричними і зчитуватися в ультрафіолетовій (УФ) області електромагнітного випромінювання.

-Колориметричний метод

Він заснований на генерації хромофору ферментативною дією. Ензимну активність можна слідкувати постійно або безперервно.

Суцільна форма

У безперервній формі реагенти поміщають у кювету в спектрофотометрі на бажаній довжині хвилі, що відповідає тій, при якій хромофор має своє максимальне значення оптичної щільності; а також, що крім того, немає ніякого втручання в іншу речовину, яка може утворюватися.

Ферментативна реакція ініціюється додаванням зразка, що містить фермент, активність якого слід визначити. Одночасно запускається секундомір, і час від часу відзначається значення оптичної щільності.

Оскільки відома еквівалентність оптичної щільності з молями субстрату або продуктом ферментативної дії, залежно від використовуваної методики можна розрахувати молі субстрату, що споживається, або вироблені родимки.

Крім того, з моменту вимірювання минулого часу ферментативної реакції можна отримати молі, спожиті або вироблені за секунду. Таким чином, ферментативна активність встановлюється в катальних одиницях.

Розривна форма

У формі партії для визначення ферментативної активності пробірки з компонентами реакції, крім зразка, що містить фермент або інший компонент, поміщають у ванну при температурі 37 ° С. Потім реакцію починають з додаванням відсутнього компонента.

Час, зазначений технікою, може відбуватися, і реакція припиняється додаванням сполуки, яка зупиняє реакцію. Оптична щільність зчитується в цей момент і, нарешті, протікає так само, як і безперервним способом визначення ферментативної активності.

-Метод показань в ультрафіолетовому світлі

Наприклад, коферментний нікотинамідамінуклеотид має дві форми: НАДН (знижений) та НАД ⁺ (окислений). Аналогічно, коензим нікотинамітіінуклеотидефосфат має дві форми НАДФН та НАДФ ⁺ , відновлений та окислений відповідно.

Як відновлювані, так і окислені форми коферменту зчитуються на довжині 260 нм від ультрафіолету; при цьому з ультрафіолетового світла зчитуються лише зменшені форми на довжині 340 нм.

Отже, і в реакціях окислення або відновлення, в яких беруть участь названі коферменти, вони зчитуються при 340 нм.

Визначення ферментативної активності, по суті, таке ж, як і в суцільній формі колориметричного методу; за винятком того, що оптична щільність при 340 нм зчитується для спостереження за генерацією NADH або NADPH або для вимірювання споживання цих коферментів.

Це залежатиме від того, чи є вимірювана реакція окисненням або відновленням. За допомогою відповідності між оптичною щільністю та молями NADH та NADPH, залежно від випадку, ферментативна активність може бути обчислена шляхом ділення молей коферменту на минулий час у секундах.

Регуляція активності ферментів

Контроль на рівні субстрату або продукту

Зі збільшенням концентрації субстрату активність ферменту збільшується. Але при певній концентрації субстрату активний сайт або активні ділянки ферменту насичуються, так що активність ферменту стає постійною.

Однак продукт ферментативної дії також може взаємодіяти з активними ділянками ферменту, виробляючи пригнічення ферментативної активності.

Продукт може діяти як конкурентний інгібітор; наприклад, можна згадати фермент гексокіназу. Цей фермент виробляє фосфорилювання глюкози, спричиняючи глюкозо-6-фосфат, сполуку, яка при накопиченні інгібує гексокіназу.

Контроль зворотного зв'язку

Може статися, що група ферментів (A, B, C, D, E і F) послідовно діє метаболічним шляхом. Фермент В використовує продукт Ензиму А як субстрат тощо.

Клітина, залежно від її метаболічних потреб, може активувати або інгібувати послідовності ферментативної діяльності. Наприклад, накопичення продукту ферменту F може діяти шляхом інгібування ферменту А або будь-якого іншого з ферментів у послідовності.

Аллостеричні ферменти

Фермент може складатися з декількох субодиниць, кожна з яких має свої активні ділянки. Але ці субодиниці не діють самостійно, тому активність однієї з субодиниць може активувати або гальмувати дію решти.

Хоча гемоглобін не вважається ферментом, він є чудовою моделлю явища аллостеризму. Гемоглобін складається з чотирьох білкових ланцюгів, двох α-ланцюгів і двох β-ланцюгів, кожен з яких приєднаний до групи гема.

Між субодиницями можуть виникнути два явища: гомоалостеризм та гетероалостеризм.

Гомоалостеризм

Зв'язування субстрату з однією з субодиниць підвищує спорідненість інших субодиниць до субстрату, в свою чергу збільшуючи ферментативну активність кожної з решти субодиниць.

Так само інгібування ферментативної активності в одній із субодиниць дає такий же ефект у решті.

Що стосується гемоглобіну, зв’язування кисню до гемової групи одного з білкових ланцюгів спричинить підвищення авідність до кисню в інших ланцюгах.

Так само вивільнення кисню з гемової групи спричиняє вивільнення кисню з решти груп білкових ланцюгів.

Гетеролостеризм

Зв'язування активуючої або інгібуючої речовини, крім субстрату, до однієї з субодиниць спричинить активацію або пригнічення ферментативної активності в інших субодиницях.

Що стосується гемоглобіну, зв’язування з гемовою групою H ⁺ , CO ₂ та 2,3-дифосфогліцератом до однієї з субодиниць знижує спорідненість групи гема до кисню, викликаючи його вивільнення. Цей викид кисню виробляється і в інших ланцюгах гемоглобіну.

Фактори, що впливають на активність ферментів

-Концентрація субстрату

Зі збільшенням концентрації субстрату активність ферментів також збільшується. Це пояснюється збільшенням доступу молекул субстрату до активних ділянок ферменту.

Але, для даної концентрації субстрату, всі активні ділянки ферменту насичуються цим, внаслідок чого ферментативна активність не збільшується, навіть якщо концентрація субстрату збільшується.

-pH від ферментативної реакції

Ферменти мають оптимальний pH, при якому спорідненість ферменту до субстрату є найвищою. При цьому рН досягається максимальне значення ферментативної активності.

Зайва кислотність або основна середовище можуть викликати денатурацію ферменту, отже, знижуючи його активність.

Профіль pH активності ферментів різноманітний. Так, наприклад, пепсин має максимальну активність між 1-2 одиницями pH; трипсин має оптимальний pH 8; і папаїн має постійну активність між діапазоном рН між 4 і 8.

-Температура ферментативної реакції

Активність ферменту збільшується зі збільшенням температури. Взагалі, активність ферментів подвоюється на кожні 10 градусів підвищення до досягнення оптимальної температури для активності ферментів.

Однак при перевищенні оптимальної температури активність ферменту має тенденцію до зниження в міру підвищення температури реакції. Це пов’язано з тим, що білки, а отже, і ферменти, зазнають денатурації через надмірне підвищення температури.

-Іонна концентрація реакції

Взагалі, ферменти мають оптимальну активність у діапазоні концентрацій, що становить від 0 до 500 ммоль / л. Однак для більш високих концентрацій активність ферменту має тенденцію до зниження.

За цих обставин певні іонні взаємодії ферментів, необхідні для їх максимальної активності, блокуються.

Список літератури

1. Сегель, IH (1975). Біохімічні розрахунки. (2- ^е видання). John Wiley & Sons, INC
2. Lehninger, AL (1975). Біохімія. (2- ^е видання). Варто видавців, вкл.
3. Mathews, CK, van Holde, KE та Ahern, KG (2002). Біохімія. (3 ^ra Edition). Пірсон Аддісон Вешлі.
4. Вікіпедія. (2019). Ферментний аналіз. Відновлено з: en.wikipedia.org
5. Гонсалес Хуан Мануель. (sf). Кінетичний фермент. Курс біомолекул. Відновлено: ehu.eus