ПРОТЕЇНАЗА K: ХАРАКТЕРИСТИКИ, ФЕРМЕНТАТИВНА АКТИВНІСТЬ, ЗАСТОСУВАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

До протеїнази є фермент , що належить до групи серинових протеаз, тобто вона має в своїй середній серин каталитически активної амінокислоти і має функцію розриву пептидних зв'язків шляхом гідролізу. У свою чергу цей фермент належить до сімейства білків субтилизина (пептидаза S8).

Протеїназа К має молекулярну масу (МВт) 28 900 дальтон і вперше була виділена в 1974 р. В екстрактах гриба альбому Engyodontium, раніше відомого як Tritirachium album Limber.

Молекулярна структура протеїнази К. Джерело: Lykchiniadis

Він має високу протеолітичну здатність, що демонструється тим, що він здатний погіршити кератин, присутній у волоссі. Слово keratin в англійській мові пишеться "кератин", звідси воно отримало назву "протеїназа К".

Завдяки високій потужності для розщеплення нативних білків, цей фермент корисний у різних методиках молекулярної біології. В основному використовується для виділення та отримання нуклеїнових кислот з високою молекулярною масою (МВт).

Протеїназа К працює, вивільняючи ядерну ДНК, при цьому руйнуючи білки та інактивуючи РНКази та ДНКази, тобто усуває нуклеази в препаратах ДНК та РНК.

З іншого боку, було видно, що протеїназа K може гідролізувати деякі денатуровані нативні білки, що викликало інтерес дослідників щодо її використання у дослідженні прионних білків (PrPC).

Однак, незважаючи на високу протеолітичну активність, є білки, стійкі до дії протеїнази К. Серед них є деякі аномальні білки, які називаються пріонами (PrPSc), пов'язані з трансмісивними спонгіформними енцефалопатіями.

Характеристики протеїнази К

Протеїназа К має третинну структуру, складену з трьох шарів, із семицепочечним β листом, розташованим між двома шарами спіралей. Оскільки він належить до сімейства пептидаз S8, він характеризується наявністю каталітичної тріади на своєму активному ділянці, послідовний порядок якої (Asp, His і Ser), що відрізняє їх від інших сімейств пептидаз.

Цей фермент із групи серинових протеаз характеризується гідролізацією пептидних зв'язків, близьких до карбонової групи аліфатичних та ароматичних амінокислот.

З іншого боку, він здатний діяти в присутності певних корозійних речовин, таких як додецилсульфат натрію (SDS), Tris-HCL та EDTA, які використовуються для допомоги денатурації білків, внаслідок чого вони втрачають рідну структуру.

Це попередній крок підготовки білків до методики електрофорезу. Діапазон pH, при якому діє протеїназа К, досить широкий (2,0 до 12,0), з оптимальним рН від 7,5 до 12,0, а його ізоелектрична точка - 8,9. Як видно, він активний проти дуже широкого діапазону pH.

Ще одна характеристика, яка виділяється у протеїнази К, - її стабільність при наявності високих температур (50 - 60 ° С).

Ферментативна діяльність

Протеїназа К вимагає наявності іона кальцію, хоча це не впливає на його активність, якщо це важливо для підтримки його стабільності.

Щоб протеїназа K повністю перетравила субстрат, необхідний контактний час приблизно від 5 хвилин до 2 годин.

Однак у цьому сенсі Даза та ін. Порівняли чистоту ДНК, отриманої в різний час впливу проти протеїнази К, і зробили висновок, що тривала інкубація (до 24 год) значно покращує якість ДНК.

Однак стосовно концентрації ферменту протеїнази К, що використовується в різних протоколах, можна сказати, що він дуже різноманітний.

Його можна використовувати від дуже низьких концентрацій (5 мкг / мл) до концентрацій 500 мкг / мл. Але найпоширеніші робочі концентрації коливаються від 50-100 мкг / мл, особливо для перетравлення білка та інактивації нуклеаз. Хоча для обробки тканин потрібна концентрація 2 мг / мл.

Програми

Її застосування дуже широке і може бути узагальнене наступним чином:

-Використовується при перетравленні білків та вилученні ДНК різними методами, такими як: засолювання, ПК-SDS, цетил-триметил амоній бромід (CTAB), модифікований ацетат калію та екстракція йодидом натрію.

-Інактивація нуклеаз (RNases та DNases).

-У техніці гібридизації in situ (HIS) для сприяння вивільненню нуклеїнової кислоти, крім усунення небажаних білків.

-Модифікація білків.

-На рівні досліджень, в різних дослідженнях.

Переваги протеїнази К

Проведено кілька порівняльних досліджень між методами вилучення ДНК, які використовують протеїназу К, з іншими, які не використовують її, і всі роблять висновок, що при використанні ферменту є більші переваги. До переваг можна віднести:

-ДНК високої молекулярної маси, високої якості та чистоти.

-Екстрагована ДНК стабільна до 3 місяців.

Екстрагована ДНК може бути використана в наступних техніках: Саузерн-блот, ланцюгова реакція полімерази (ПЛР), електрофорез, серед інших.

Білки, стійкі до протеїнази К

В різних дослідженнях було зроблено висновок, що пріони (аномально токсичні білки PrPSc) відрізняються від PrPC (нативних) білків стійкістю до дії протеїнази K, тоді як PrPC чутливі до її дії.

Інші автори описали, що в структурі PrPSc є чутливі частини та інші, стійкі до протеїнази K. Однак обидві частини однаково токсичні та інфекційні.

З іншого боку, Bastian та ін. У 1987 році виділили 4 білка 28, 30, 66 та 76 кда від виду Spiroplasma mirum. Було виявлено, що всі вони стійкі до дії протеїнази K, а також мали перехресну реакцію з деякими прионами.

Відомо, що цей вид може спричинити катаракту та важливі неврологічні пошкодження, і завдяки науковим висновкам Бастіана, серед інших досліджень, було зроблено спробу пов’язати цей мікроорганізм із трансмісивними спонгіформними енцефалопатіями.

Однак етіологія цієї дегенеративної неврологічної патології продовжує приписуватися пріонам і сьогодні.

У цьому сенсі Butler та ін. В 1991 році ідентифікували та охарактеризували клас білка, стійкого до протеїнази К, 40 кда, із двох штамів Mycoplasma hyorhinis. Цей збудник вражає свиней, заражаючи їх тканини, але в цьому випадку не було перехресної реакції з тестованими прионами.

Для вирішення багатьох невідомих в цьому плані потрібно більше досліджень.

Список літератури

1. Bastian F, Jennings R та Gardner W. 1987. Антисерум до поперечно реагує на фібрильний білок фібрилу, пов'язаний зі скрепією, з фібрильними білками Spiroplasma miru m. J. Clin. Мікробіол. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Оцінка методу вилучення та очищення ДНК з м'язової тканини, фіксованої формальдегідом, невстановлених трупів. Журнал "Мед", 2014; 22 (1): 42-49,
3. Батлер Г, Котані Н, Конг Л, Фрік М, Еванчо С, Стенбрідж Е та Макгарріті Г. Ідентифікація та характеристика протеїназних стійких до протеїнів білків у членів класу Молікути. Інфекція та імунітет, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. Лопес М, Рівера М, В’єтрі М, Ларес М, Морокойма А, Ерера Л та ін. Порівняння двох протоколів вилучення ДНК Trypanosoma cruzi, вирощених в аксенічному середовищі. Преподобний Перу. Медична експертиза охорони здоров'я 2014; 31 (2): 222-227. Доступно за адресою: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E і Palma W. Визначення ефективності п'яти протоколів вилучення ДНК з парафінованого матеріалу для молекулярних досліджень. Преподобний Мед Унів Коста-Ріка. 2007 р .; 1 (1): 10-19.