ТЕСТ НА ОКСИДАЗУ: ОБГРУНТУВАННЯ, ПРОЦЕДУРА ТА ЗАСТОСУВАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Тест на оксидазу - це метод діагностики, який показує наявність ферментного комплексу під назвою цитохром оксидаза c. Ця система індукує перетворення цитохрому, зведеного до окисленого, оскільки він захоплює кисень, а це, в свою чергу, виступає як останній акцептор електронів (Н ⁺ ) у дихальному ланцюзі.

Термін оксидаза - це скорочений спосіб посилання на фермент цитохромоксидазу, також відомий як індофенолоксидаза. У давнину вважали, що ферменти цитохромоксидаза та індофенолоксидаза - це два різні ферменти, але сьогодні, як відомо, вони однакові.

Позитивний та негативний тест на оксидазу. Джерело: Не надано машиночитаного автора. Alpha.prim ~ commonswiki передбачається (на основі претензій щодо авторських прав).

Зі свого боку, цитохроми - це гемопротеїни, які містять залізо і завершують систему цитохромоксидази. Цитохроми можуть відрізнятися від видів до видів.

Існують різні різновиди цитохромів (цитохроми a1, a2, a3 і 0). Деякі бактерії можуть виробляти лише одну, а інші до двох-трьох одночасно. У цьому сенсі присутність цитохрому a і a3 відома як цитохром оксидаза c. Це тип цитохрому, який виявляє тест оксидази.

Роди Neisseria і Pseudomonas містять цитохром оксидазу c. Ці пологи дають позитивний тест на оксидазу, допомагаючи диференціювати їх відповідно від родів Acinetobacter та Stenotrophomonas.

Існують також інші пологи, які мають позитивний оксидазу.

Основа

Характеристика системи цитохром оксидази с

Система цитохромоксидази с працює таким чином: мікроорганізми, сприятливі до оксидази, використовують кисень для отримання енергії за допомогою аеробного дихання. Ця система працює завдяки транспортуванню електронів від донорських речовин, таких як НАДН ⁺ до рецепторних речовин, в даному випадку кисню.

Це призводить до отримання енергії (АТФ) і води або перекису водню, залежно від системи цитохромоксидази, якою володіє мікроорганізм.

Ось чому більшість оксидазних позитивних бактерій також є позитивними до каталази, необхідною умовою для усунення утворюється перекису водню, оскільки ця речовина токсична для бактерій.

Система цитохромоксидази с присутня в деяких аеробних бактеріях, деяких факультативних анаеробах, декількох мікроаерофільних і не має суворих анаеробів. Останнє зрозуміло, оскільки суворі анаероби не можуть жити в присутності кисню, тому їм не вистачає цитохромоксидазної системи.

Принцип випробування

У цьому тесті він використовує речовини, які діють як штучні акцептори електронів, замінюючи природні речовини в ланцюзі транспорту електронів.

В основному використовуються барвники, такі як парафенілендіамін та індофенол, які діють як субстрати рецепторів та штучні донори електронів.

Парафенілендіамін окислюється системою цитохромоксидази с. Барвник у зменшеному вигляді є безбарвним, але в окисленому вигляді - кольоровим.

Ось як свідчить наявність системи цитохромоксидази с; оскільки позитивна реакція буде генерувати лавандовий або синьо-фіолетовий колір залежно від використовуваного реагенту.

З іншого боку, якщо остання приймаюча електрона речовина в дихальному ланцюгу відрізняється від кисню, тест на оксидазу буде негативним (відсутня кольорова продукція); це справа з анаеробними мікроорганізмами.

Так само, якщо цитохром, який використовується мікроорганізмом, відрізняється від цитохромоксидази c, він також дасть негативний тест.

Процес

Існують різні реагенти та протоколи для тесту на оксидазу, все з тією ж метою.

Реагенти

Реагент Ковач, реактор Гордона та Маклеода, реагент Наді, Карпентер, Сурланд та Моррісон, а також використання оксидазних дисків.

-Реактив оксидази Ковач

Він складається з 1% тетраметил-п-фенілендіаміну дигідрохлориду.

Реактив Ковачса готують шляхом розчинення 1 г вищезгаданої речовини в 50 мл дистильованої води. Його нагрівають тонко до повного розчинення. Перенесіть в бурштинову пляшку достатньої ємності і доведіть об’єм до 100 мл дистильованою водою. Зачекайте принаймні 15 хвилин перед використанням. Зберігати в холодильнику, захищеному від світла.

Він позначений як реагент Ковачса оксидази, щоб відмежувати його від реагенту Ковачса, який використовується для виявлення проби Індолу. Цей реагент є найбільш чутливим, менш токсичним, але дорожчим, ніж решта реагентів.

Позитивна реакція буде свідчити з цим реагентом зі зміною кольору колонії на лаванду, яка швидко стає фіолетовою майже чорною. Негативна реакція очевидна через те, що в колонії немає зміни кольору або вона набуває легкого рожевого кольору. Засіб також може потемніти, але це не означає позитивної реакції.

З цим реагентом час реакції має вирішальне значення, зміна кольору, яке відбувається між 5-15 секундами, вважається позитивною реакцією.

-Реагент Гордон та МакЛоуд

Він складається з дигідрохлориду диметил-р-фенілендіаміну, також відомого як N-диметил-р-фенілендіамін або моногідрохлориду п-амінодиметиланіліну. Він готується так, як описано для реагенту оксидази Ковачса, замінюючи відповідну речовину.

Цей реагент дещо стійкіший, ніж реагент оксидази Ковачса, хоча всі реагенти, що містять р-фенілендіамін, нестабільні.

Ця реакція пізніше, її інтерпретують як позитивну із появою синьо-фіолетового кольору протягом 10 - 30 хвилин.

-Надій реагент

Він складається з 1% α-нафтолу в етиловому спирті (95% етанол) та 1% амінодиметиланіліну. Суміш готують в рівних частинах і використовують абсолютний етиловий спирт як розріджувач, поки не буде складено достатня кількість для 100 мл.

- реагент Карпентер, Сурланд та Моррісон

До його складу входить 1% р-амінодиметилаланінового оксалату. Готують так само, як описано для реагенту оксидази Ковачса, змінюючи відповідну речовину.

З готовим розчином тест-смужки готують наступним чином: 6-8 см смужки фільтрувального паперу Whatman №1 просочують 1% реагентом диметил-р-фенілендіамін оксалату.

Їм дозволяють висихати без контакту з металом, зберігати в закритих гвинтовими банками з осушувачем і зберігати в холодильнику. Ці смужки стійкі до 6 місяців.

Це найстабільніший реагент з усіх згаданих і може тривати до 6 місяців у розчині. Ще одним плюсом є те, що воно не забарвлює середовище навколо колонії, якщо воно використовується безпосередньо на тарілці.

Поява червоного кольору трактується як позитивний тест.

-Оксидазні диски

Це комерційні диски, просочені реагентом для тесту на оксидазу. На ринку є кілька комерційних брендів.

Його використання цілком практичне, оскільки готувати свіжі реактиви не потрібно, що полегшує роботу. Отримані результати є надійними, якщо диски належним чином збережені.

Протоколи

Метод прямої пластинки, непрямий метод на папері та використання дисків, просочених реагентами оксидази.

-Прямий метод ради

2 або 3 краплі будь-якого з вищезазначених реагентів додаються для цієї мети безпосередньо в колонії (колони), що містяться в тарілці з культуральним середовищем, яка не містить глюкози.

Зміна або відсутність кольору колоній тлумачиться не середовищем. Дійсний час реакції залежить від використовуваного реагенту.

-Непрямий метод на папері

Відріжте шматок фільтрувального паперу (Whatman № 1) розміром 6 см ² і помістіть його всередину порожньої чашки Петрі.

Додайте в папір 2 або 3 краплі реагенту оксидази Ковачса, візьміть частину досліджуваної колонії платиновою ручкою або дерев’яною зубочисткою і викладіть її прямою лінією на просочений реагентом папір. Інтерпретувати протягом 5 - 10 секунд.

За допомогою смуг, підготовлених реагентом Карпентера, Сурленда та Моррісона, на суху смугу викладається колонія. Одну смужку використовують для тестування декількох штамів. Інтерпретувати за 10 сек.

-Диски (м

Тонко змочіть комерційні диски стерильною дистильованою водою і накладіть на досліджувану колонію. Рекомендується використовувати тарілки при температурі 35 ° C, якщо використовуються пластини кімнатної температури або холодильні тарілки, реакція відбувається трохи повільніше. Інтерпретуйте зміну кольору від 10 до 20 сек.

Можна використовувати колонії, що містяться в крові або шоколадному агарі.

-Диски (непрямий метод)

Змочіть диск, як описано раніше. Помістіть його в порожню чашку Петрі. Візьміть достатню кількість колонії для дослідження за допомогою платинової ручки або дерев’яної зубочистки і покладіть на диск. Інтерпретуйте зміну кольору від 10 до 20 сек.

Використовуйте

Рід Neisseria та Acinetobacter іноді дуже схожий морфологічно, тому що, хоча рід Acinetobacter є грамонегативним стрижнем, він іноді може приймати коккоїдну форму і поширюватися парами, імітуючи рід Neisseria.

У цьому випадку тест на оксидазу дійсно корисний. Рід Neisseria позитивний, а Acinetobacter негативний.

Однак рід Moraxella дуже схожий на рід Neisseria і обидва дають позитивну реакцію; Ось чому випробування на ферментацію вуглеводів завжди повинні проводитися для остаточної ідентифікації.

З іншого боку, тест на оксидазу корисний для розмежування бактерій, що належать до сімейства Enterobacteriaceae (всі оксидазні негативні) від інших ферментерів, таких як рід Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (оксидаза позитивна).

Рід Vibrio та Helicobacter також позитивно впливає на оксидазу.

QA

Використовуйте відомі штами кишкової палички як негативний контроль, а штами Pseudomonas aeruginosa - як позитивний контроль.

Обмеження

-Реагенти повинні використовуватися свіжоприготованими, термін їх зберігання в розчині при кімнатній температурі короткий, оскільки вони дуже нестійкі. У холодильнику вони можуть тривати від 5 днів до 2 тижнів.

-Реагенти безбарвні, якщо вони змінюють колір, їх потрібно викинути. Пошкоджені диски з’являються, оскільки з часом темніють.

-Позитивна реакція з реагентом оксидази Ковачса між 15-60 сек вважається запізнілою реакцією, а через 60 секунд слід вважати негативною.

-Heemophylus influenzae дає негативну реакцію оксидази, якщо використовується який-небудь реагент з диметил-р-фенілендіаміном, але позитивну, якщо використовується реагент оксидази Ковач (тетраметил-р-фенілендіамін).

-Медіуми, що містять глюкозу, заважають тесту, даючи помилкові негативи.

- Штам коклюшу бордетелли може дати помилкову позитивну реакцію, якщо вони походять з висококонцентрованих пластинок агару крові.

-Використання металевих (залізних) ручок дає хибну позитивну реакцію.

рекомендації

- Оскільки реагенти дуже нестабільні і мають тенденцію до самоокислення, рекомендується заморожувати аликвоти від 1 до 2 мл і видалити за необхідності.

-Інший спосіб затримати автоокислення реагенту - додавання 0,1% аскорбінової кислоти при приготуванні реагентів.

-Якщо реагенти нестабільні, рекомендується щотижневий контроль якості.

-Регенти, які не пройшли тест контролю якості, не повинні використовуватися.

Список літератури

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. 5-е видання. Редакція Panamericana SA Аргентина.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Мікробіологічна діагностика Бейлі та Скотта. 12 ред. Редакція Panamericana SA Аргентина.
3. "Тест на оксидазу". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 15 січня 2018, 10:32 UTC. 3 квітня 2019, 14:03
4. Всесвітня організація охорони здоров'я. Лабораторний посібник з виявлення та тестування чутливості до антимікробних препаратів бактеріальних збудників важливості для здоров'я в країнах, що розвиваються. 2004. Доступно за адресою: who.int/drugresistance/infosharing
5. Смуги реагенту для діагностики активності оксидази в бактеріях. Преподобна Кубана Мед Троп. 2000 р .; 52 (2): 150-151.