ІМУНОФЛУОРЕСЦЕНЦІЯ: ОБГРУНТУВАННЯ, ПРОТОКОЛ ТА ПРОГРАМИ - БІОЛОГІЯ - 2025

Імунофлюоресценції є потужним засобом імунного фарбування з використанням антитіл , ковалентно пов'язаних з флуоресцентними молекулами , щоб ідентифікувати конкретну мету в зразках клітин , фіксованих на тверду підкладку.

Ця методика передбачає мікроскопічне спостереження з імунологічною специфічністю, що дозволяє спостерігати живі або мертві клітини, які можуть містити незначну кількість антигенів. Він широко використовується як в галузі досліджень, так і в клінічній діагностиці різних патологій.

Імуномаркулювання актинових ниток у клітинах кардіоміоцитів (Джерело: Ps1415 через Wikimedia Commons)

Ця методика, в основному якісна (з деякими кількісними варіантами), пов'язана конкретно з візуалізацією зразка продуктовим сигналом фторофору, який є флуоресцентною молекулою, пов'язаною з антитілом і яка здатна збуджуватися на певній довжині хвилі. .

У клітинному контексті дуже корисно вивчити наявність / відсутність та надклітинне розташування білків. Спочатку ця методика використовувалася в клінічних умовах для діагностики вірусів, таких як грип, а згодом і для багатьох інших інфекційних захворювань.

Це дуже чутлива техніка, і за допомогою відповідного обладнання для мікроскопії вона може мати дуже хорошу роздільну здатність. Для його спостереження потрібне використання конфокальних або епіфлюоресцентних мікроскопів.

Однак, незважаючи на те, що він користується великою популярністю, він може представляти деякі важливі проблеми щодо отримання неспецифічної флуоресценції, яка генерує певний фоновий «шум», що часто обмежує адекватне зчитування результатів.

Основа

Імунофлуоресценція заснована на використанні біологічного явища реакції взаємодії між антитілом та антигеном. Це стосується конкретно візуалізації чи виявлення цієї реакції шляхом збудження флуоресцентних молекул до певної довжини хвилі.

Антитіло - це білок імуноглобуліну, секретується з активних В-клітин, який спеціально генерується проти антигену, до якого він може зв’язуватися з високою спорідненістю та специфічністю. Імунофлуоресценція використовує імуноглобуліни IgG, які є розчинними в сироватці крові.

Антитіла - це молекули до 950 кДа, що складаються з двох коротких (легких) та двох довгих пептидних ланцюгів у формі "Y". І легка, і важка ланцюги поділяються на дві області: одна змінна, здатна розпізнавати антиген, а інша константна або збережена, характерна для кожного виду.

Антигени функціонально визначаються як молекули, які можуть бути розпізнані антитілом і, здебільшого, є білками. Коли тварина піддається впливу антигену, лімфоцити імунної системи активізуються, виробляючи специфічні антитіла проти нього, і вони функціонують як захисна система.

Антиген, такий як білок, наприклад, може мати більш ніж один епітоп або місце розпізнавання антитілом, таким чином сироватка тварини, що зазнає впливу антигену, може мати поліклональні антитіла проти різних областей одного білка.

Імунофлуоресценція, таким чином, використовує здатність тварини виробляти поліклональні антитіла проти конкретного антигену з метою його очищення та подальшого використання для виявлення того ж антигену в інших контекстах.

Серед флуоресцентних барвників або молекул, які найбільш використовуються для деяких методів імунофлуоресценції, є ізотіоціанат флуоресцеїну (FITC), тетраметилродамін ізотіоціанат-5 і 6 (TRITC), багато цианінів, таких як Cy2, Cy3, Cy5 і Cy7, і барвники, звані Alexa Fluor® , наприклад, Alexa Fluor®448.

Протокол

Протокол імунофлуоресценції змінюється залежно від багатьох факторів, однак, загалом кажучи, він включає лінійну послідовність етапів, що складається з:

• Підготовка пластин і клітин
• Фіксація зразків
• Пермеабілізація
• Блокування
• Імунозабарвлення або імунофарбування
• Збірка та спостереження

-Підготовка

Зразків

Підготовка зразків буде залежати від їх характеру та типу досвіду, який слід здійснити. Найпростіший випадок, що передбачає використання клітин у суспензії, буде пояснено нижче.

Клітини в суспензії, тобто в рідкому культуральному середовищі, спочатку повинні бути відокремлені від неї центрифугуванням, а потім повинні бути промиті буферним розчином або ізосмотичним «буфером», що зберігає їх цілісність.

Зазвичай використовують фосфатно-сольовий буфер, відомий як PBS, в якому клітини ресуспендують і цю суміш знову центрифугують, щоб отримати клітини, вільні від культурального середовища, які можуть містити перешкоджаючі речовини.

З лез

Слайди, які використовуються для мікроскопічного спостереження, де клітини будуть згодом закріплені для відповідних обробок нижче, також повинні бути ретельно підготовлені.

Вони покриті або «сенсибілізовані» розчином полілізину, синтетичного полімеру, який буде діяти як «молекулярний клей» між клітинами і твердою підкладкою, завдяки електростатичній взаємодії між позитивними зарядами їх аміногруп та негативні заряди на білки, що покривають клітини.

Фіксація зразків

Цей процес складається з іммобілізації білків, виявлених всередині клітини, щоб зберегти їх просторове розташування неушкодженим. Використовувані молекули повинні бути здатними перетинати всі типи клітинних мембран та утворювати ґрати з ковалентними білками.

Широко застосовуються формальдегід і параформальдегід, глутаральдегід і навіть метанол, з якими зразки клітин інкубують певний час, а потім промивають ізосмотичним буферним розчином.

Після фіксації клітин вони продовжують прикріплюватися до листів, раніше чутливих до полілізину.

Пермеабілізація

Залежно від типу тесту, який проводиться, потрібно буде проникнути досліджувані клітини чи ні. Якщо потрібно шукати - це розташування, присутність чи відсутність певного білка на клітинній поверхні, пермеабілізація не буде необхідною.

З іншого боку, якщо ви хочете знати місце розташування білка всередині клітини, пермеабілізація є важливою і полягає в інкубації зразків з тритоном X-100, миючим засобом, здатним проникати в клітинні мембрани.

Блокування

Фундаментальним кроком у всіх імунологічних методах є блокування. На цьому етапі процедури блокування складається з покриття на сенсибілізованих листах усіх ділянок з молекулами полілізину, до яких клітини не приєдналися. Тобто це заважає будь-якому неспецифічному союзу.

Зазвичай розчини з альбуміном бичачої сироватки (BSA) в буфері PBS використовуються для блокування, і чим найкращі результати отримують, тим довше час інкубації з цим розчином. Після кожного кроку, включаючи блокування, необхідно змити залишок розчину.

Імунозабарвлення або імунофарбування

Процедура иммуноокрашивания або иммуноокрашивания буде залежати головним чином від того, чи це пряма чи непряма імунофлуоресценція (див. Нижче).

Якщо це первинна або пряма імунофлуоресценція, зразки будуть інкубуватися з бажаними антитілами, які повинні бути зв'язані з флуоресцентними барвниками. Процедура інкубації полягає у введенні розведення антитіла в розчин, який також буде містити BSA, але в меншій пропорції.

У випадку вторинної або непрямої імунофлуоресценції слід проводити дві послідовні інкубації. Спочатку з бажаними антитілами, а потім з антитілами, які здатні виявляти константні ділянки первинних імуноглобулінів. Саме ці вторинні антитіла ковалентно зв'язуються з фторофорами.

Методика дуже універсальна, дозволяє одночасно маркувати більше одного антигену на зразок, якщо існують первинні антитіла, пов'язані з різними флюорофорами, у разі прямої імунофлуоресценції.

Для одночасного маркування в непрямій імунофлуоресценції необхідно забезпечити, щоб кожне первинне антитіло вироблялося в іншої тварини, а також, щоб кожне вторинне антитіло було пов'язане з іншим фторофором.

Як і блокування, інкубація з антитілами дає кращі результати, чим довший час цього. Після кожного етапу необхідно змивати надлишки антитіл, які не зв'язувалися з пробами, і при вторинній імунофлуоресценції необхідно блокувати перед додаванням вторинного антитіла.

Деякі методи використовують інші плями, які не пов'язані з імунофарбуванням, такі як фарбування ядерної ДНК фторофором DAPI.

Збірка та спостереження

Під час останнього часу інкубації з фторофорами необхідно, щоб зразки залишалися в темряві. Для спостереження під мікроскопом прийнято використовувати деякі речовини для збереження флуоресценції флуорофорів у поєднанні з антитілами.

Типи

Графічний підсумок прямої та непрямої імунофлюоресценції (Джерело: Westhayl618 через Wikimedia Commons)

Пряма або первинна імунофлуоресценція

Це пов'язано з виявленням антигенів за допомогою використання флуоресцентних антитіл. Головною перевагою використання цієї методики є її швидкість, однак у процесі може виникнути багато випадків неспецифічного зв'язування, особливо при вивченні сироваток людини, оскільки вони багаті високогетерогенними антитілами.

Непряма або вторинна імунофлюоресценція

Він також відомий як "сендвіч" техніка, і це передбачає розвиток методики в два етапи. Перше стосується використання нефлуоресцентного антитіла та його зв'язування з цікавим антигеном.

Проти константної області цього першого антитіла (яка тепер буде служити антигеном) використовується друге антитіло, здатне його розпізнати, яке пов'язане з флуоресцентною молекулою.

Поява флуоресцентного сигналу буде результатом специфічного розпізнавання між першим нефлуоресцентним антитілом та цікавим антигеном; наявність цього першого антитіла обумовлює стан другого, який є міченим, і завдяки якому можна визначити наявність або відсутність антигену.

Незважаючи на те, що це набагато більш трудомістка методика, ніж пряма імунофлуоресценція (оскільки вона включає ще один етап інкубації), ця методика не передбачає розробки флуоресцентного антитіла для кожного досліджуваного антигену, в результаті чого, в економічному плані, більш життєздатні.

Крім того, це більш чутлива техніка з точки зору посилення сигналу, оскільки більше одного вторинного антитіла може зв'язуватися з константною областю первинного антитіла, посилюючи тим самим інтенсивність флуоресцентного сигналу.

Програми

Як вже зазначалося раніше, імунофлуоресценція - надзвичайно універсальна методика, яка багато в чому застосовується в науковій та клінічній галузях. З його допомогою можна відповісти на екологічні, генетичні та фізіологічні питання стосовно багатьох організмів.

Серед клінічних застосувань він використовується для прямої діагностики деяких дерматологічних захворювань, або за допомогою прямої або непрямої імунофлуоресценції на епітеліальній тканині досліджуваних пацієнтів.

Методи імунофлуоресценції були доступні для одноклітинних організмів, таких як дріжджі, для візуалізації внутрішньоядерних та цитоплазматичних мікротрубочок, актину та асоційованих білків, ниток 10 нм та інших складових цитоплазми, мембрани та клітинних стінок.

Список літератури

1. Abcam, імуноцитохімія та протокол імунофлуоресценції. Отримано з abcam.com
2. Греф, C. (2012). Флуоресцентні барвники. Отримано з leica-microsystems.com
3. Miller, DM, і Shakest, DC (1995). Імунофлуоресцентна мікроскопія. «Методи клітинної біології» (т. 48, с. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, і Cook, D. (2013). Методи імунофлуоресценції. Журнал слідчої дерматології, 133, 1–4.
5. Принтер, BJR, Адамс, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Імунофлуоресцентні методи для дріжджів. Методи ензимології (т. 194, с. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Застосування імунофлуоресценції у вірусології охорони здоров'я. Бактеріологічні огляди, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG, Anderson, DM (1996). Імунофлуоресценція у фітопланктонових дослідженнях: застосування та потенціал. J: Фікол. , 32, 1–16.