ЗАСІБ LÖWENSTEIN-JENSEN: ОСНОВА, ПІДГОТОВКА ТА ВИКОРИСТАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Левенштейн-Йенсена середовище являє собою селективну тверду середу для виділення і розвитку бактерій роду Mycobacterium, таких як мікобактерій туберкульоз, М. AVIUM, серед іншого, за винятком виду лепри, яка не є культивованої.

Бактерії роду Mycobacterium не ростуть у звичайних культуральних середовищах, тому для їх виділення необхідно було розробити спеціальне середовище. Оригінальний носій був створений Левенштайн і пізніше модифікований Дженсеном.

Середовище Левенштайна-Йенсена з колоніями Mycobacterium tuberculosis. Джерело: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., люб’язно надано Бібліотекою зображень біології

Модифікація полягала в усуненні червоного барвника Конго, замінивши його більш високою концентрацією малахітового зеленого. Він також змінив концентрації цитрату магнію та монокалієвофосфату.

Середовище Левенштейна-Йенсена в даний час містить картопляний крохмаль, аспарагін, цитрат магнію, монокалієвий фосфат, магній сульфат, малахітовий зелений, налідиксусна кислота, циклогексимід, лінкоміцин, збиті яйця, гліцерин та воду.

Мікобактерії зазвичай виділяють із нестерильних ділянок, таких як мокрота, сеча, абсцеси тощо. Це означає, що більшість зразків будуть містити звичайну мікробіоти області, плюс збудник.

Ось чому середовище Левенштайн-Йенсен містить у своєму складі ряд інгібіторів, представлених малахітовим зеленим, антибіотиками та протигрибковими препаратами.

Крім того, зразки, які надходять з нестерильних ділянок, перед дезінфекцією в середовище Левенштайн-Йенсен повинні бути знезаражені та знешкоджені.

Основа

Присутність яєць та гліцерину в середовищі Левенштайн-Дженсен стимулює ріст мікобактерій, оскільки вони забезпечують жирні кислоти та білки, необхідні для розвитку цих мікроорганізмів.

Середовище Левенштайн-Йенсен містить малахітовий зелений колір, який є інгібітором супутньої мікробіоти. Але він також містить налідіксинову кислоту (35 мкг / мл), яка інгібує грамнегативні мікробіоти, циклогексимід (400 мкг / мл), який інгібує сапрофітні гриби та дріжджі, та лінкоміцин (2 мкг / мл), який пригнічує грампозитивні мікробіоти.

Деякі комерційні будинки вважають за краще додавати наступну комбінацію антибіотиків: поліміксин В 200 000 од. / Л, амфотерицин В 10 мг / л, карбеніцилін 50 мг / л і триметоприм 10 мг / л.

Ця середовище не містить агару, тому затвердіння середовища відбувається за рахунок згортання альбуміну, присутнього в яйці під час стерилізації.

Підготовка

Зважте 37,3 г зневодненого середовища в 600 мл дистильованої води, до якої раніше додавали 12 мл гліцерину. Суміш нагрівають, часто перемішуючи до повного розчинення. Автоклавуйте середовище при 121 ° С протягом 15 хвилин.

З іншого боку, гомогенну суспензію на 1000 мл свіжих яєць слід приготувати в асептичних умовах. Додайте яєчну суспензію до 600 мл середовища, приготованого при температурі 50 - 60 ° C, уникаючи бульбашок повітря.

Антибіотичні розчини також додаються після стерилізації в автоклаві.

Залийте засіб у стерильні пробірки з гвинтовими кришками. Прогрійте пробірки при 85 ° С протягом 45 хвилин у похилому положенні.

Колір підготовленого середовища - аквамарин зелений і може містити білясті плями через наявність яєчних ліпідів.

РН середовища повинен бути 7,2 ± 0,2

Зберігайте пробірки в холодильнику та захищених від прямого освітлення до використання. Температура перед посівом.

Існує модифікація середовища, що називається "Модифікація Груфта Левенштайна Дженсена". Він містить ті ж сполуки, що і класичне середовище, але додають РНК-5 мг / 100 мл, а в якості інгібіторів він містить малахітовий зелений 0,025 г / 100 мл, пеніцилін 50 Од / мл і налідиксинову кислоту 35 мкг / мл.

Програми

Середовище Левенштайна-Йенсена використовується для виділення мікобактерій з різних видів зразків. Пляма Циель-Нельсена рекомендується застосовувати для будь-яких зразків, у яких підозра на наявність мікобактерій.

Деякі зразки надходять зі стерильних майданчиків, а інші - ні. Нестерильні зразки повинні бути дезінфіковані:

Мокрота

Зразки мокротиння слід знезаражувати наступним чином: визначають кількість проби мокротиння в мл і додають ту ж кількість 4% NaOH до зразка та інкубують при 37 ° С.

Часто струшуйте суміш протягом 30 хвилин. Згодом центрифугу при 3000 об / хв протягом 30 хвилин.

Відкиньте супернатант над фенольним дезінфікуючим розчином. Використовуйте осад для посіву, але спочатку рН необхідно нейтралізувати.

Для нейтралізації осаду використовується 5% H ₂ SO ₄ в присутності фенольного червоного індикатора, поки він не досягне нейтрального рН, який спричиняє колір лосося.

Промивання шлунка, промивання бронхів та бронхіальний аспірат

У цьому випадку зразок необхідно центрифугувати при 3000 об / хв протягом 30 хвилин. Супернатант викидається і гранули використовуються. Для знезараження осаду додають 3 мл 4% NaOH і часто перемішують при 37 ° С протягом півгодини.

Знову центрифугу супернатант відкидають і гранулу використовують. Останні необхідно нейтралізувати, як пояснено у зразку мокротиння.

Сеча

Дайте пробі відстоятися в холодильнику протягом 24 годин. Розділіть супернатант. Решту гранул слід центрифугувати протягом 30 хвилин при 3000 об / хв. Знову відкиньте супернатант і відновлюйте гранули 3 мл стерильного фізіологічного розчину.

Додайте 3 мл 4% NaOH і приступайте до дезактивації та нейтралізації, як описано раніше.

Асцитна рідина, плевральна рідина, спинномозкова рідина

У цьому типі зразка він центрифугується і супернатант викидається. Виконай грам на осаді або спостерігай безпосередньо під мікроскопом; Якщо бактерії не спостерігаються, етап дезактивації не є необхідним, також не є етапом нейтралізації.

У цьому випадку зразок можна висівати безпосередньо за допомогою осаду. Якщо є бактерії, приступайте до знезараження та нейтралізації, як описано вище.

Біопсії

До цього типу зразка необхідно подати 5 мл дистильованої води для подальшої центрифуги при 1500 об / хв протягом 10 хвилин. Відкиньте супернатант і повторно центрифугуйте гранули при 3500 об / хв протягом 30 хвилин. Використовуйте осад для посіву культурального середовища.

Ларингеальний тампон

Тампон слід помістити у стерильну пробірку, що містить рівні частини дистильованої води та 4% NaOH. Тампон необхідно притиснути до стінок пробірки, щоб зразок розбавився в рідині. Центрифугуйте і використовуйте осад. Нейтралізуйте осад, як уже було описано.

Посіяно

Середовище Левенштайна-Йенсена інокулюють шляхом додавання 0,5 мл зразка на поверхню середовища. Оберніть трубку, щоб розподілити зразок по всьому середовищу. Не використовуйте платинову ручку.

Друга трубка, що містить середовище Stonebrink, може бути посіяна для виділення Mycobacterium bovis та інших видів, які не ростуть на середовищі Левенштайн-Йенсен.

Інкубація

Інокульовані пробірки інкубують аеробно при 37 ° С, при цьому кришка трохи пухка і нахилена приблизно на 5 ° та захищена від світла. Навколишнє середовище може бути збагачене 5–10% вуглекислого газу. Перевіряйте культури двічі на тиждень до появи колоній.

Коли проба була поглинена, ковпачки натягують. Максимальний час інкубації - 8 тижнів, якщо після закінчення цього періоду не спостерігається зростання, він повідомляється як негативний.

QA

У якості контролю якості можуть використовуватися такі штами:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogec 320 ATccocco 320 ATCcoc, 320 ATC, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC 27, 41

Відмінний розвиток очікується для перших трьох згаданих видів, для M. fortuitum зростання має бути хорошим, тоді як для M. bovis мало або взагалі не очікується зростання. Тим часом інші види, крім роду Mycobacterium, повинні бути повністю пригнічені.

Обмеження

Підготовлене середовище повинно бути захищене від світла, тривале потрапляння світла призводить до того, що середовище перетворюється з зеленого на синє, в цьому випадку засіб більше не можна використовувати. Це тому, що малахітовий зелений світлочутливий.

Середовище, оскільки воно містить яйця, може бути легко забруднене, якщо з ним не звертатися асептично. Його можна розчинити, якщо він забрудниться протеолітичними бактеріями.

Для вирощування та маніпулювання бактеріями роду Mycobacterium потрібен кваліфікований персонал, який обізнаний з заходами біозахисту, яких слід дотримуватися, щоб уникнути зараження чи зараження інших.

HCl не слід застосовувати на етапі нейтралізації через утворення хлориду натрію, який може бути токсичним для бацила Коха.

Зразки слід зберігати в холодильнику та захищати від світла, не переробляючи їх.

Довідково

1. Лабораторії Франсіско Сорії Мельгуїзо 2009. Вибірковий носій Левенштайн-Йенсен. Доступно за адресою: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Засіб Левенштайн-Йенсен. Доступно за адресою: britanialab.com.
3. Неогенні лабораторії. Середовище Левенштайн-Йенсен. Доступно за адресою: foodsafety.neogen.com.
4. "Середовище Левенштайн-Йенсен". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 20 листопада 2018, 15:15 UTC. 24 квітня 2019, 18:34 wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. 5-е видання. Редакція Panamericana SA Аргентина.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Мікробіологічна діагностика Бейлі та Скотта. 12 ред. Редакція Panamericana SA Аргентина.
7. Мак Фаддін Дж. (2003). Біохімічні тести для виявлення бактерій клінічного значення. 3-е вид. Редакція Panamericana. Буенос-Айрес. Аргентина.