РЕКОМБІНАНТНА ДНК: ТЕХНІКА, ЗАСТОСУВАННЯ ТА ОСНОВИ - БІОЛОГІЯ - 2025

Рекомбінантної ДНК (РДНК або РДНК) являє собою штучний молекулу нуклеїнової кислоти , створеної в лабораторії, за рахунок інтеграції двох сегментів процентних організацій. Він також відомий як химерна ДНК, завдяки своїй гібридній властивості. Цей тип ДНК не зустрічається в природі.

Основна методологія його отримання включає: (а) відбір цільової ДНК та її введення в інший фрагмент ДНК (як правило, бактеріальна плазміда); (b) введення цієї плазміди в бактерію, (c) виділення бактерій за допомогою антибіотиків і, нарешті, (d) експресія гена.

Джерело: pixabay.com

Методика використовує набір ферментів, які дають можливість копіювати та вставляти конкретні фрагменти ДНК за судженням дослідника.

Мета рекомбінантної технології в більшості випадків - експресія білка (відомий як рекомбінантний білок), бажаний молекулярним біологом для майбутніх досліджень, або для створення білка комерційної та терапевтичної цінності - наприклад, людського інсуліну, наприклад.

Основи методики рекомбінантної ДНК та її використання в генній інженерії

Центральна догма молекулярної біології

Усі органічні істоти, яких ми знаємо, мають декілька характеристик. Один з них - природа генетичного матеріалу та спосіб виготовлення білків - процес, відомий як центральна «догма» молекулярної біології.

За винятком пари вірусів, усі організми зберігають генетичну інформацію в ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота), зібрану дуже компактно і організовано в ядрі клітини.

Для експресії генів молекула ДНК транскрибується в месенджерну РНК, а остання перекладається мовою амінокислот, будівельних блоків білків.

Що таке рекомбінантна ДНК?

У період з 1970-х до 1980-х років молекулярні біологи почали користуватися процесами, які природним чином відбуваються всередині клітини і змогли екстраполювати їх у лабораторію.

Таким чином, ген тваринного походження (хребетний, наприклад) міг бути вставлений у сегмент ДНК бактерії; або ДНК бактерії може поєднуватися з вірусною ДНК. Таким чином, ми можемо визначити рекомбінантну ДНК як молекулу, що складається з ДНК двох різних організмів.

Після створення цієї гібридної або рекомбінантної молекули експресується ген. Із виразом слова ми хочемо звернутися до процесу перекладу білка.

Рестрикційні ферменти та лігази: ключ до процесу

Ключовим елементом у розробці технології рекомбінантних ДНК було відкриття рестриктазних ферментів.

Це білкові молекули, які виявляють здатність розщеплювати ДНК (нуклеази) на конкретні послідовності, слугуючи "молекулярними ножицями". Фрагменти, що утворюються цими ферментами, називають фрагментами рестрикції.

Згадані ферменти можуть виробляти симетричні надрізи в цільовій послідовності (в обох ланцюгах на однаковій висоті) або асиметричні надрізи. Ключовим аспектом дії ферментів рестрикції є те, що після розщеплення ланцюгів виходить «пухкий край», доповнюючи інший край, розрізаний тим же ферментом.

Деякі приклади - ECOR 1 і Sma 1. В даний час відомо більше 200 видів рестрикційних ферментів, комерційно доступних.

Щоб бути корисним, ножиці повинні супроводжуватися клеєм. Ця герметизуюча дія ДНК (раніше обробленої рестрикційними ферментами) здійснюється лігазами.

Методика: як у лабораторії штучно модифікується ДНК організму?

Нижче ми опишемо основні кроки, яких потребує технологія рекомбінантної ДНК. Всі вони виконуються професіоналами в лабораторії молекулярної біології.

Що таке "клон"?

Перш ніж продовжувати експериментальний протокол, ми маємо зазначити, що в молекулярній біології та біотехнології широко використовуються термін «клон» та дієслово «клон». Це може призвести до плутанини.

У цьому контексті ми маємо на увазі не клонування цілого організму (як, наприклад, у відомої вівці Доллі), а клонування шматочка ДНК, який може бути геном. Тобто, створюючи безліч копій - генетично однакових - послідовності.

1. Виділення та отримання ДНК

Перший крок - визначити, яку послідовність ви хочете використовувати. Це повністю залежить від дослідника та цілей його роботи. Потім цю ДНК необхідно виділити та очистити. Способи та процедури досягнення цього залежать, в свою чергу, від організму і тканини.

Як правило, шматочок тканини беруть і піддають обробці в буфері лізису протеїназою К (протеолітичним ферментом), після чого ДНК екстрагують. Згодом генетичний матеріал фрагментується на невеликі фрагменти.

2. Клонування вектор

Після підготовчих кроків дослідник прагне ввести сегмент ДНК, що цікавить, у вектор клонування. Відтепер ми будемо називати цей сегмент ДНК білою ДНК.

Плазміди

Один з найбільш використовуваних векторів у плазміді бактеріального походження. Плазміда - це дволанцюгова кругова молекула ДНК, яка природним чином міститься в бактеріях. Вони бактеріальні хромосоми сторонні - тобто вони є екстрахромосомними, і природними є у цих прокаріотів.

Основними елементами вектора є: (а) походження реплікації, що дозволяє синтезувати ДНК; (b) селекторний агент, який дає можливість ідентифікувати організми, які переносять плазміду з цільовою ДНК, таку як резистентність до деякого антибіотика; та (c) мультиклонінг-сайт, де знайдені послідовності, які будуть розпізнані рестрикційними ферментами.

Першу успішну рекомбінантну ДНК в лабораторії клонували в плазміду pSC101 з бактерії E. coli. Він містить сайт рестрикції для рестрикційного ферменту EcoRI та ген резистентності до антибіотика, крім походження реплікації.

Введення цільової ДНК у плазміду здійснюється за допомогою молекулярних інструментів рестрикційних ферментів та лігаз, описаних у попередньому розділі.

Залишилися векторні типи

Крім плазмід, ДНК може бути вставлена ​​в інші вектори, такі як лямбда бактеріофага, косміди, YACs (дріжджові штучні хромосоми), BAC (штучні бактеріальні хромосоми) та фагеміди.

3. Введення рекомбінантної ДНК

Після отримання рекомбінантної молекули ДНК (гена, що цікавить плазміду чи іншого вектора), вона вводиться в організм господаря або господаря, який може бути бактерією.

Для введення чужорідної ДНК в бактерію використовується техніка, яка називається бактеріальною трансформацією, коли організм піддається лікуванню двовалентними катіонами, що робить його сприйнятливим до прийому ДНК.

Методологічно ми не можемо гарантувати, що 100% бактерій у нашій культурі ефективно взяли нашу молекулу рекомбінантної ДНК. Тут грає частина плазміди, яка містить стійкість до антибіотиків.

Таким чином, бактерії, які взяли плазміду, будуть стійкими до певного антибіотика. Для їх вибору буде достатньо застосувати зазначений антибіотик і забрати тих, хто вижив.

4. «Збирати» білок

Виділивши бактерії з нашою рекомбінантною ДНК, ми переходимо до використання ферментативного механізму господаря для отримання білкового продукту, який цікавить. У міру розмноження бактерій плазміда передається їх потомству, тому вона не втрачається під час поділу.

Ця процедура використовує бактерії як своєрідну білкову «фабрику». Пізніше ми побачимо, що це була дуже актуальна процедура в розробці ефективних медичних методів лікування.

Як тільки культура готова і бактерії виробили велику кількість білка, клітина лізується або руйнується. Існує широкий спектр біохімічних методик, що дозволяють очистити білки відповідно до їх фізико-хімічних характеристик.

В іншому експериментальному контексті ми можемо не зацікавлені в генеруванні білка, але, скоріше, ми зацікавлені в отриманні послідовності ДНК як такої. Якби це було так, плазміду використовували б для створення декількох копій цікавого фрагмента, щоб мати достатньо цільової ДНК для проведення відповідних експериментів.

Програми

Рекомбінантна технологія ДНК відкрила нескінченну кількість можливостей у молекулярній біології, біотехнології, медицині та інших суміжних областях. Найвидатнішими її застосуваннями є наступні.

Генетичний аналіз

Перше застосування безпосередньо пов'язане з лабораторіями молекулярної біології. Рекомбінантна технологія ДНК дозволяє дослідникам зрозуміти нормальну функцію генів, а генеровані білки можуть бути використані в подальших дослідженнях.

Фармацевтична промисловість

Білки, отримані за допомогою процедури рекомбінантної ДНК, мають застосування в медицині. Два дуже релевантні приклади в цій галузі - людський інсулін і гормон росту, який застосовують у пацієнтів, яким не вистачає цього білка.

Завдяки рекомбінантній ДНК ці білки можуть генеруватися без необхідності витягати їх з іншої людини, що представляє додаткові методологічні ускладнення та ризики для здоров'я. Це допомогло покращити якість життя незліченних пацієнтів.

Список літератури

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). Біологія 2. Grupo редакційна патрія.
2. Cooper, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000). Клітина: молекулярний підхід (т. 10). Вашингтон, округ Колумбія: Преса ASM.
3. Devlin, TM (2004). Біохімія: підручник з клінічним застосуванням. Я перевернувся.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Роль рекомбінантної технології ДНК для покращення життя. Міжнародний журнал геноміки, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Патологічна анатомія. Elsevier Іспанія.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Вступ до мікробіології. Panamerican Medical Ed.
7. The MJ (1989). Людський інсулін: перший препарат ДНК-технології. Американський журнал Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.