СТАНДАРТНИЙ БІСЕР АГАРУ: ОБГРУНТУВАННЯ, ПІДГОТОВКА ТА ВИКОРИСТАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Стандартний лічильник агар являє собою твердий, що не селективної культуральному середовищі, призначеної для кількісного визначення аеробного мікробного навантаження даний час в пробах питної води, стічних вод, молочних напоїв, серед інших харчових продуктів. Цей засіб також відомий як агар PCA, за його абревіатурою в англійській Plate Count Agar. Він був створений у 1953 році Бухбіндером, Барісом та Голдштейном.

Стандартне агарове середовище складається з екстракту дріжджів, триптеїну, глюкози, агару та дистильованої води. Цей склад містить основні харчові елементи, що дозволяють розвинути існуюче аеробне мікробне навантаження, не вимогливе.

Десяткові розведення для підрахунку CFU в стандартних підрахунках агару. Джерело: Квентін Гейсман

Оскільки середовище не містить інгібіторів, бактерії можуть рости без будь-яких обмежень, що робить його ідеальним для загального підрахунку колоній. Однак методика кількісного визначення пластин не виявить усіх присутніх бактерій, а лише тих, які здатні рости в умовах навколишнього середовища, яким підданий посівний стандартний агар.

У цьому сенсі методика кількісного визначення пластин зазвичай прагне визначити кількість бактерій аеробного мезофільного типу, тобто тих, що ростуть при температурі від 25 до 40 ° С, з оптимальною температурою росту 37 ° С. .

Ця бактеріальна група дуже важлива, оскільки там знаходиться більшість патогенних бактерій для людини.

Слід зазначити, що іноді може бути цікавим кількісна оцінка кількості психрофільних бактерій, присутніх у їжі. Ці бактерії є тими, що ростуть при низькій температурі (<20 ° C) і відповідають за те, що їжа швидше розкладається, навіть коли їх охолоджують.

Так само термофільні бактерії, які розвиваються в діапазоні від 50 ° C до 80 ° C або більше, можуть мати важливе значення для деяких видів їжі, таких як консерви.

Мікробне кількісне визначення виражається в колонієутворюючих одиницях (CFU) на грам або мілілітр зразка.

Основа

Стандартне лічильне середовище розроблене для того, щоб забезпечити успішний ріст невмілих аеробних бактерій, як дріжджовий екстракт, триптейн та глюкоза, забезпечуючи необхідні поживні речовини для хорошого росту мікробів.

З іншого боку, середовище має світле забарвлення та прозорий зовнішній вигляд, саме тому воно ідеально підходить для візуалізації колоній, розроблених методом глибокого висіву (заливка пластинами).

Також можливий підрахунок колоній методом висіву на поверхню шпателем Дригальського.

Коли величина мікробного навантаження велика, слід робити десяткові розведення досліджуваного зразка, щоб можна було підрахувати CFU.

Слід зазначити, що цей засіб рекомендується Американською асоціацією громадського здоров'я (APHA) для підрахунку аеробних мезофілів.

Підготовка

Зважте 23,5 г зневодненого середовища і розчиніть в літрі дистильованої води. Щоб повністю розчинитися, суміш слід нагрівати, часто помішуючи, поки вона не закипить. Подальші етапи залежать від технології висіву, яка буде використовуватися.

Для техніки заливки пластини

Розподіліть, роздаючи 12–15 мл у пробірки. Згодом стерилізують в автоклаві при 121 ° С протягом 15 хвилин. Дайте твердіти вертикально у формі блоку. Зберігати в холодильнику до використання.

Розплавіть пробку, коли збираєтесь її використовувати. Після розплавлення зберігайте його на водяній бані при 44-47 ° C, поки зразки готуються.

Для поверхневого сівби

Стерилізуйте засіб в автоклаві при 121 ° C і потім розподіліть по 20 мл у стерильний посуд Петрі. Дайте твердіти, переверніть і зберігайте в холодильнику до використання.

Пластини перед використанням. РН середовища повинен бути 7,0 ± 0,2.

Використовуйте

Стандартний граф агар використовується в техніці аеробного мезофільного підрахунку під час мікробіологічного аналізу води та їжі. Кількість аеробних мезофілів є необхідною, оскільки вона визначає санітарну якість досліджуваного зразка.

Застосування цієї методики (з використанням цього середовища) дозволяє макроскопічно візуалізувати виділені колонії для їх кількісного визначення.

Техніка наливання пластин (висівання глибини)

-Процес

Методика складається з наступного:

1) Гомогенізувати зразок, щоб перерозподілити наявні бактерії.

2) Початкова суспензія робиться в стерильній пляшці або мішку, дотримуючись співвідношення 10 г або 10 мл проби в 90 мл розчинника (10 ^-1 ).

3) Від початкової суспензії проводять відповідні десяткові розведення залежно від типу зразка. Вихід: (10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 ). Розведення проводять пептоновою водою або фосфатним буфером.

Для цього беруть 1 мл початкової суспензії і поміщають її в 9 мл розріджувача, продовжують розведення, якщо потрібно, тепер беруть 1 мл розведення 10 ^-2 тощо.

4) Візьміть по 1 мл кожного розведення і помістіть у порожній стерильний посуд Петрі.

5) Додайте в кожну тарілку 12 - 15 мл стандартного агару, попередньо розплавленого та відстояного при 44 - 47 ° C.

6) Акуратно обертайте пластини, щоб рівномірно розподілити зразок уздовж агару і дати йому затвердіти.

7) Переверніть пластини та інкубуйте при 37 ° С в аеробіозі протягом 24 - 48 годин.

8) Після закінчення часу планшети досліджують і колонії підраховують при розведенні, що це дозволяє. Для підрахунку вибираються ті пластини, які мають від 30 до 300 CFU.

Підрахунок можна здійснити вручну або використовувати обладнання лічильника колоній.

Допустимі значення на мл зразка можуть відрізнятися від країни до іншої залежно від регламенту, яким вони керуються.

-Розрахунок UFC

Загальний розрахунок проводиться за такою формулою:

Формула для загального розрахунку кількісного визначення CFU. Джерело: Національна адміністрація лікарських засобів, харчових продуктів та медичних технологій (ANMAT). Мікробіологічний аналіз їжі, офіційна аналітична методологія, індикаторні мікроорганізми. 2014. Том 3. Доступно за адресою: anmat.gov.ar

Результати виражте в 1 або 2 цифрах, помноживши на відповідну базу 10. Приклад: якщо результат дорівнює 16 555, він округляється на основі третьої цифри до 17 000 і виражатиметься так: 1,7 х 10 ⁴ . Тепер, якщо результат був 16,436, округніть його до 16 000 і виражіть 1,6 х 10 ⁴ .

Техніка поверхневого висіву

-Процес

-Inocular з 0,1 мл прямого зразка, якщо він рідкий, початкова суспензія 10 ^-1 або послідовне розведення 10 ^-2 , 10 ^-3 і т.д., в центрі стандартної тарілки з лічильником агару.

-Розподіліть зразок рівномірно шпателем Дригальського або скляним стрижнем у формі L. Нехай він відпочиває 10 хвилин.

-Поверніть тарілки та інкубуйте аеробним шляхом при 37 ° С протягом 24 - 48 годин.

-Перелічіть колонії, вибирайте ті пластини, які знаходяться в межах від 20 до 250 КУО.

-Розрахунок UFC

Для розрахунку застосовується коефіцієнт розведення, який є зворотним. Число округляється до 2 значущих цифр (округлення відповідно до третьої цифри) і виражається потужністю бази 10. Наприклад, якщо 224 CFU підраховуються у вибірці без розведення (10 ^-1 ), повідомляється 22 x 10 ¹ CFU , але якщо ця цифра становила 225, повідомляється 23 х 10 ¹ CFU.

Тепер, якщо підрахунок 199 КУО буде розрахований у розведенні 10 ^-3 , повідомляється про 20 х 10 ⁴ КУО, але якщо 153 КУО підраховуються в тому ж розведенні, повідомляється про 15 х 10 ⁴ КУО.

QA

Стандартне культуральне середовище можна оцінити, використовуючи відомі сертифіковані штами, такі як: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Якщо культуральне середовище знаходиться в оптимальних умовах, очікується задовільний ріст у всіх випадках, за винятком L. fermentum, який може мати регулярний урожай.

Для оцінки стерильності культурального середовища одну або дві пластини кожної підготовленої партії (без щеплення) слід інкубувати при температурі 37 ° С в аеробіозі протягом 24 годин. Після закінчення цього часу в середовищі не повинно спостерігатись зростання або зміна кольору.

Обмеження

-Не розплавляйте агар більше одного разу.

-Підготовлений засіб може тривати до 3 місяців, якщо він зберігається в холодильнику і захищений від світла.

-Це середовище не підходить для вимогливих або анаеробних мікроорганізмів.

Список літератури

1. Національна адміністрація лікарських засобів, харчових продуктів та медичних технологій (ANMAT). Мікробіологічний аналіз їжі, офіційна аналітична методологія, індикаторні мікроорганізми. 2014. Том 3. Доступно за адресою: anmat.gov.ar
2. Робітник Діфко Франциско Сорія Мельгуїзо, С.А. 2009. Доступний за адресою: http://f-soria.es
3. Conda Pronadisa Laboratories. Стандартний метод агар (PCA) відповідно до APHA та ISO 4833. Доступний за адресою: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Кількість пластини агару 2015. Доступний за адресою: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B та Velázquez O. 2009. Методи мікробіологічного аналізу харчових продуктів. 2-е вид. Хімічний факультет, УНАН. Мексика. Доступно за адресою: depa.fquim.unam