ПОСЛІДОВНІСТЬ ДНК: МАКСАМ-ГІЛБЕРТ, МЕТОД ТА ПРИКЛАДИ - БІОЛОГІЯ - 2025

Секвенування ДНК (дезоксирибонуклеїнової кислоти) являє собою процедуру , в молекулярній біології лабораторій , що дозволяє , щоб знати порядок нуклеотидів в генетичному матеріалі інтерес. Крім того, може бути розкрито секвенування РНК (рибонуклеїнової кислоти).

Ця методика була незамінною для розвитку біологічних наук. Це також застосовно до інших галузей знань - наприклад, медичної діагностики та судових розслідувань, наприклад.

Джерело: pixabay.com

Раніше секвенування ланцюга ДНК вважалося повільною і дорогою діяльністю, що дозволило ідентифікувати лише кілька пар основ в олігонуклеотидах.

Сьогодні, маючи всі досягнення в галузі науки, секвенування ДНК - це звичайна операція в багатьох лабораторіях по всьому світу завдяки внеску майже 50 років досліджень у цій галузі. З точки зору довжини ланцюга, до мільйонів пар основ можна секвенувати за дуже короткий час.

Для цього розроблено десятки методик, які відрізняються ціною та точністю. У цій статті ми розповімо як класичні, так і сучасні методики, кожна зі своїх переваг та недоліків.

До цих пір методи секвенування дозволяють отримати послідовність повних геномів, від невеликих прокаріотів і дріжджів до геному людини.

Структура ДНК

Щоб зрозуміти методи та прийоми, що використовуються для секвенування ДНК, необхідно знати певні ключові аспекти будови та складу молекули.

ДНК - це біомолекула, яка міститься у всьому живому, від бактерій до великих водних тварин. Органели - як мітохондрії та хлоропласти - мають циркулярну молекулу ДНК всередині них. Навіть у деяких вірусів знайдений генетичний матеріал - це ДНК.

Структурно ДНК - це сукупність нуклеотидів. Кожен складається з вуглеводів, азотистої основи (A, T, C або G) та фосфатної групи. Мета послідовності ДНК - виявити порядок, в якому в послідовності знайдено чотири азотисті основи.

Історія

У середині 50-х років дослідники Уотсон і Крик описали структуру ДНК за допомогою христолографічних прийомів. Однак жодному з цих дослідників не вдалося знайти спосіб розгадати послідовність.

Хоча були певні попередники, найважливішою подією було створення методу Сангера, у 1977 році. Фредерік Сангер, батько методу, був британським біохіміком, лауреатом двох Нобелівських премій за величезний внесок у біологічні науки.

Ця методика також відома в літературі як "припинення ланцюга" або дідеоксинуклеотиди. Принципи цієї методики та ті, які були розроблені на основі її вдосконалення та інновацій, будуть описані нижче.

Захисний метод

Розробка методу Сангера була важливою подією в молекулярній біології. Він включає основні компоненти процесу реплікації ДНК, які зазвичай відбуваються в клітині, але додають спеціальний компонент: дідеоксинуклеотиди.

Основні компоненти реакції

- ДНК-полімераза: фермент ДНК-полімераза є важливим елементом процесу. Ця молекула бере участь у реплікації ланцюга ДНК, її роль полягає в синтезі нової ланцюга, з’єднуючи трифосфатні дезоксирибонуклеотиди з комплементарними.

Нагадаємо, що в ДНК тиміни (Т) з’єднуються з аденінами (А) через дві водневі зв’язки, а цитозин (С) робить це з гуаніном (Г) через три зв’язки.

- Нуклеотиди: безпечне секвенування включає два типи нуклеотидів, чотири 2'-дезоксинуклеотиди (скорочено dATP, dGTP, dCTP і dTTP) та чотири дідеоксинуклеотиди (ddATP, ddGTP, ddCTP і ddTTP).

Хоча дідеоксинуклеотиди схожі на мономери, які зазвичай включаються в ДНК, їм не вистачає групи -OH у своїй структурі. Це унеможливлює додавання нового нуклеотиду до ланцюга.

Тому, коли до ланцюга в утворенні додається спеціальний нуклеотид - цілком випадковим чином - синтез паралізується. Таким чином, в кінці реакції виникають ланцюги різної величини, кожен з яких реакцію зупиняли в іншій точці.

Експериментально підготовлено чотири тести. Кожна містить ДНК, витягнуту з біологічного зразка, що цікавить, нормальних нуклеотидів та одного з чотирьох спеціальних типів нуклеотидів. Або спеціальні нуклеотиди позначені деяким типом флуоресцентного маркера (див. Автоматизоване послідовність нижче).

Читання результатів

Перший крок - відокремлення кожної з синтезованих ланцюгів відповідно до їх розмірів. Деякі будуть довші за інших, залежно від того, де були закладені спеціальні бази.

Існують різні біохімічні методи, які дозволяють відокремлювати компоненти суміші, використовуючи розмір як дискримінаційну властивість. У методі Сангера різні ланцюги розділені електрофорезом. У більш досконалих варіантах методики застосовується капілярний електрофорез.

Таким чином, довші пасма подорожують менше, ніж більш короткі варіанти. Потім ця система проходить через зчитувач, який розпізнає маркер, включений у кожен дідеоксинуклеотид. Таким чином може бути відомий порядок послідовності.

Ця методика "першого покоління" здатна зчитувати фрагменти ДНК розміром не більше 1 кілобази. В даний час метод Сангера використовується в різних лабораторіях, як правило, в його сучасних варіантах. Крім того, він використовується для підтвердження отриманих результатів найскладнішими методами - але менш точними.

Автоматичне секвенування

Коли потрібні послідовності в великих масштабах, процес прискорюється за допомогою автоматизації. Це варіант способу припинення ланцюга Сангера, де праймери маркують флуоресцентними продуктами з метою їх розрізнення.

Згодом продукт реакції протікає в електрофорезі - все по одній смузі. Оскільки кожен фрагмент виходить з кінцевої порції гелю, його швидко ідентифікують за допомогою флуоресцентного маркування з похибкою, що оточує 1%.

У найскладніших системах є система до 96 капілярних труб, якими керує комп’ютер, з'єднаний з роботом. Тобто 96 зразків ДНК можуть бути протестовані одночасно. Таким чином, процес, що включає електрофорез та аналіз результатів, повністю автоматизований.

За один день ці системи можуть послідовно використовувати до 550 000 баз. Під час процесу людська праця непотрібна, для запуску методу потрібно лише близько 15 хвилин.

Максем-Гілберт послідовності

У той же час, коли Сангер опублікував свою роботу, двом дослідникам на ім’я Аллан Максан та Уолтер Гілберт вдалося розробити інший метод отримання послідовності ДНК. Метод набув популярності в той час, але згодом був витіснений вдосконаленням методу Сангера.

На відміну від методу Сангера, секвенування Максана та Гілберта (або хімічне секвенування, як це також відомо) не передбачає реакцій гібридизації. Методика складається з маркування реактивних агентів на одному кінці з подальшим процесом очищення.

Один з негативних аспектів цієї методики полягає у її величезній складності та у використанні хімічних речовин, небезпечних для користувача. Хімічні розриви викликаються застосуванням ДМС, мурашиної кислоти, гідразину та гідразину з солями.

Процес

Протокол починається з маркування на 5 'кінці нитки фосфорним маркером 32, потім відбувається хімічна модифікація азотної основи і вона відокремлюється. Нарешті, відбувається розщеплення абасичної області.

Спочатку ви скорочуєте рядок, який хочете послідовно, на менші сегменти. Цей етап виконується з рестрикційними ферментами, які призводять до виступаючих кінців.

Далі реакцію проводять з лужною фосфатазою, мета якої - усунення фосфатної групи. Таким чином, полінуклеотидна кіназа може бути використана для здійснення маркування.

Ланцюг денатурований (дві пасма відкриті). Потім застосовуються хімічні речовини. Ці реакції розщеплення проводяться контрольованим способом, і відомо, які типи зв’язків застосовують кожен хімічний розрив.

Читання результатів

Як і у методі Сангера, зчитування результатів передбачає розділення за розміром ланцюгів, отриманих в системі електрофорезу. Системи, що складаються з поліакриламіду, дозволяють отримати дуже адекватну роздільну здатність для зчитування гелю.

Масове секвенування

Масивна послідовність охоплює низку нових методів, скорочених як NGS, від англійської “Next Generation Sequencing”.

Методи, класифіковані як NGS, вимагають попереднього етапу ампліфікації ДНК (вони не працюють з однією молекулою). Крім того, використовувані платформи сильно різняться. Принципи найбільш популярних методів будуть описані нижче:

Піросекція

Він включає моніторинг вивільнення пірофосфату, який відбувається щоразу, коли до ланцюга ДНК додається новий нуклеотид. Система ферментів з'єднана таким чином, що випромінювання світла (яке детектується камерою) відбувається щоразу, коли вводиться новий нуклеотид.

Процес починається з окремої інкубації кожної основи азоту, щоб перевірити, чи немає випромінювання світла. Піросекціонування може читати довгі нитки, але виявлений рівень помилок високий.

Синтезування послідовності

Це передбачає включення мічених нуклеотидів. Ці флуоресцентні компоненти додаються, промиваються та відзначається вбудований нуклеотид. Потім нуклеотидна мітка видаляється, і синтез нитки може продовжуватися. На наступному етапі також буде включений мічений нуклеотид, і вищезазначені етапи будуть повторені.

Недолік цієї методики виникає, коли флуоресцентні маркери не видаляються повністю. Ці викиди створюють фонові помилки, що призводять до значних помилок.

Послідовність перев'язки

Ця методика відрізняється від інших тим, що в ній не використовується ДНК-полімераза. Натомість ключовим ферментом цієї методики є лігаза. Тут використовуються флуоресцентно фрагменти ДНК, вона пов'язана ферментом і виявляється.

Найбільша проблема цієї техніки - це коротка довжина фрагмента, яку вона здатна обробити.

Послідовність іонних потоків

Ця методика заснована на вимірюванні іона Н ^+, який вивільняється кожного разу при включенні нового нуклеотиду. Принцип досить схожий на пірослідування, але набагато дешевший.

Приклади

Послідовність геному людини

Послідовність геному людини була однією з найперспективніших проблем у біології, а також є одним із найвідоміших суперників в історії науки. Насправді, для вчених, які брали участь у проекті, послідовність геному стала конкуренцією.

У 1990 році він розпочав називати «проект геному людини», очолюваний відомим вченим, лауреатом Нобелівської премії Джеймсом Уотсоном. Через рік, у 1991 році, Вентер бере на себе виклик "побити" Уотсона і послідувати геном перед ним. Однак у 1992 році Ватсон пішов у відставку, і команду взяв інший дослідник.

У 1995 році Вентер оголосив про свій успіх у повному послідовності бактеріального геному методом випадкового секвенування. Так само протирічна команда оголосила через рік секвенування геному дріжджів.

У 2000 р. Ступінь було припинено. Обидві компанії опублікували свої попередні результати генома у двох найпрестижніших наукових журналах: Nature and Science.

Однак вчені продовжували працювати над вдосконаленням пропозицій, і в 2006 році послідовності певних хромосом людини були завершені.

Важливість та застосування

Знання порядку нуклеотидів такої важливої ​​молекули, як ДНК, цінна для біологів та суміжних фахівців. Цей ланцюг полінуклеотидів містить всю інформацію, необхідну для розвитку та підтримки всіх форм життя.

З цієї причини знання цієї послідовності є важливим для біологічних досліджень. Принципово, секвенування дозволяє виміряти одне з найважливіших властивостей біологічних систем та встановити відмінності між ними.

Послідовності широко використовуються таксономістами та систематизаторами, оскільки певні послідовності ДНК дозволяють встановити критерії для висновку, належать чи два організми до одного виду, на додаток до того, що вони можуть пропонувати гіпотези про філогенетичні зв’язки між ними.

Крім того, секвенування ДНК має застосування в медицині та діагностиці. Наприклад, існують недорогі та доступні системи, які за допомогою секвенування дозволяють оцінити тенденцію до розвитку певних захворювань (наприклад, раку), використовуючи так звані одиничні нуклеотидні поліморфізми (SNPs).

Розслідування кримінального та криміналістичного типу також були збагачені прийомами послідовності, які можуть бути використані як надійні докази участі певної особи у злочині.

Список літератури

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Послідовність секвенсорів: історія секвенування ДНК. Геноміка, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Революція послідовності наступного покоління та її вплив на геноміку. Сот., 155 (1), 27-38.
3. Леві, Дж. (2010). Наукові змагання. Від Галілея до проекту геному людини. Редакція Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, AR (1977). Секвенування ДНК інгібіторами закінчення ланцюга. Праці Національної академії наук, 74 (12), 5463-5467.
5. Шустер, SC (2007). Послідовність наступного покоління перетворює сьогоднішню біологію. Природні методи, 5 (1), 16.
6. Сю, Дж. (Ред.). (2014). Послідовність наступного покоління Caister Academic Press.