ПЛЯМА ZIEHL-NEELSEN: ОБГРУНТУВАННЯ, РЕАКТИВИ ТА ТЕХНІКА - БІОЛОГІЯ - 2025

Ціль-Нільсеном забарвлює метод для ідентифікації мікроорганізмів , стійкий алкоголь кислоти (ARA). Назва цієї мікробіологічної процедури позначає її авторів: бактеріолог Франц Зель та патолог Фрідріх Нельсен.

Ця методика є різновидом диференціального фарбування, що передбачає використання різних барвників з метою створення контрасту між структурами, які ви хочете спостерігати, диференціювати та пізніше ідентифікувати. Пляма Циль-Нельсена використовується для ідентифікації певних типів мікроорганізмів.

Пляма Зіель-Нельсена

Деякі з цих організмів - це мікобактерії (наприклад, Mycobacterium tuberculosis), нокардія (наприклад, Nocardia sp.), А також деякі одноклітинні паразити (наприклад, Cryptosporidium parvum). Багато бактерій можна класифікувати за допомогою загальної методики, яка називається плямою по Граму.

Однак деякі групи бактерій потребують інших методів, щоб мати можливість їх ідентифікувати. Такі методи, як пляма Циель-Нельсена, вимагають комбінацій барвників з теплом, щоб закріпити колишню на клітинній стінці.

Потім відбувається процес відбілювання, який дозволяє отримати два результати: стійкість або чутливість до знебарвлення кислотами та спиртами.

Основа

Обґрунтування цієї техніки фарбування базується на властивостях клітинної стінки цих мікроорганізмів. Стіна складається з типу жирних кислот, званих миколевими кислотами; Вони характеризуються тим, що мають дуже довгі ланцюги.

Коли жирні кислоти мають дуже довгу структуру, вони можуть легше зберігати барвники. Деякі бактеріальні пологи дуже важко пофарбувати плямою за Грамом, через високий вміст міколевої кислоти в клітинній стінці.

У плямі Цюля-Нельсена використовується фенольна сполука карбол-фуксин, основна пляма. Це має здатність взаємодіяти з жирними кислотами клітинної стінки, яка має воскову текстуру при кімнатній температурі.

Фарбування карболовим фуксином посилюється при наявності тепла, оскільки віск плавиться, а молекули барвника швидше переміщуються в клітинну стінку.

Кислота, яка використовується згодом, служить для знебарвлення клітин, які не були забарвлені, оскільки їх стінка не була достатньо пов'язана з барвником; тому міцність кислотного відбілювача здатна видалити кислотний барвник. Клітини, які протистоять цьому знебарвленню, називаються кислотними.

Вторинний барвник

Після знебарвлення зразка він протиставляється іншому барвнику, який називається вторинним барвником. Зазвичай використовується метиленовий синій або малахітовий зелений.

Вторинний барвник забарвлює фоновий матеріал і, отже, створює контраст із структурами, які були забарвлені на першому етапі. Тільки знебарвлені клітини поглинають другий барвник (протистояння) і набувають їх забарвлення, тоді як швидкокислотні клітини зберігають свій червоний колір.

Ця процедура часто використовується для ідентифікації Mycobacterium tuberculosis та Mycobacterium leprae, які називаються кислотно-швидкими бацилами.

Реагенти

Первинний барвник

Застосовується 0,3% карболового фуксину (фільтрується). Цей барвник готують із суміші спиртів: фенолу в етанолі (90%) або метанолі (95%), і в цій суміші розчиняють 3 грами основного фуксину.

Відбілюючий розчин

На цьому етапі можна використовувати розчини 3% спиртової або 25% сірчаної кислоти.

Вторинний барвник (протибарвний)

Барвник, який найчастіше використовується для порівняння зразків, зазвичай 0,3% метиленовий синій. Однак можна використовувати і інші, наприклад, 0,5% малахітового зеленого.

Техніка

Процедура фарбування кислотою швидко

Підготуйте бактеріальний мазок

Ця підготовка проводиться на чистому сухому слайді, дотримуючись запобіжних заходів щодо стерильності.

Сушка мазка

Дайте мазку висохнути при кімнатній температурі.

Нагрійте зразок

Зразок слід нагрівати, піддаючи вогонь до слайду внизу. Фіксацію алкоголю можна здійснити, коли мазок не був підготовлений мокротою (обробляється гіпохлоритом натрію, щоб відбілити її), і якщо він не збирається негайно плямити.

М. туберкульоз видаляють хлорним вапном і в процесі фарбування. Теплова фіксація необробленої мокротиння не вб'є М. tuberculosis, тоді як фіксація алкоголю бактерицидна.

Покрийте пляму

Пляма покрита розчином карболового фуксину (первинна основна пляма).

Нагрійте пляму

Це робиться за 5 хвилин. Ви повинні помітити виділення пари (приблизно 60 ° C). Важливо не перегрівати і уникати опіку зразка.

Що стосується нагрівання плями, то слід бути дуже обережним при нагріванні карболового фуксину, особливо якщо фарбування проводиться на лотку або іншому контейнері, в якому зібрані легкозаймисті хімічні речовини попереднього фарбування.

Під слайдами слід нанести лише невелике полум'я, використовуючи попередньо освітлений тампон, змочений кількома краплями кислого спирту, метанолу або 70% етанолу. Уникайте використання великого тампона, змоченого в етанолі, оскільки це небезпека від пожежі.

Вимийте пляму

Це промивання необхідно робити чистою водою. Якщо водопровідна вода не є чистою, промийте мазок відфільтрованою або дистильованою водою, бажано.

Мазок покрийте кислим спиртом

Цей кислотний спирт повинен бути на рівні 3%. Покриття проводиться протягом 5 хвилин або поки мазок не знебарвиться достатньо, тобто блідо-рожевого кольору.

Необхідно враховувати, що кислий спирт горючий; тому використовувати його потрібно з великою обережністю. Уникайте поблизу джерел займання.

Вимийте пляму

Мити слід чистою дистильованою водою.

Покрийте мазок плямою

Це може бути пляма від малахітового зеленого (0,5%) або метиленового синього (0,3%) протягом 1 - 2 хвилин, використовуючи довший час, якщо мазок тонкий.

Вимийте пляму

Знову слід використовувати чисту (дистильовану) воду.

Злити

Задню частину гірки слід очистити, а пляма помістити на дренажну стійку, щоб вона змогла висохнути на повітрі (не використовуйте вбиральний папір для сушіння).

Вивчіть мазок під мікроскопом

Необхідно використовувати об'єктив 100X і занурення. Систематично скануйте мазок і записуйте відповідні спостереження.

Інтерпретувати результати

Теоретично мікроорганізми, які забарвлюють червонувату забарвлення, вважаються позитивно кислотно-позитивними (AAR +).

Навпаки, якщо мікроорганізми забарвлюються в синій або зелений колір, залежно від барвника, який використовується як протибарвний барвник, вони вважаються негативно сприятливими для кислоти (AAR-).

Список літератури

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Основи практичної мікробіології (1-е видання). Медичні видавці братів Джейпі.
2. Бауман, Р. (2014). Мікробіологія із захворюваннями системи тіла (4-е видання). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Вступна мікробіологія (1-е видання). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Лабораторний посібник та робочий зошит з мікробіології: додатки до допомоги пацієнтам (11-е видання). Освіта McGraw-Hill.
5. Вашантакумарі, Р. (2007). Підручник з мікробіології (1-е видання). Публікації BI PVT.