РЕСТРИКЦІЙНІ ФЕРМЕНТИ: ФУНКЦІЇ, ТИПИ ТА ПРИКЛАДИ - БІОЛОГІЯ - 2025

Ці ферменти рестрикції є ендонуклеази , що використовуються деякими архей і бактерій для пригнічення або «обмежити» поширення вірусів всередині. Вони особливо поширені в бактеріях і є частиною їх оборонної системи проти чужорідної ДНК, відомої як система обмеження / модифікації.

Ці ферменти каталізують розщеплення дводіапазонної ДНК у певних місцях, відтворюваних та без використання додаткової енергії. Більшість вимагає присутності таких кофакторів, як магній або інші двовалентні катіони, хоча деякі також потребують АТФ або S-аденозилметіоніну.

Схема реакції рестрикційного ензиму HindIII (Джерело: Helixitta через Wikimedia Commons)

Ендонуклеази на обмеження були відкриті в 1978 році Деніелом Натансом, Арбер Вернером та Гамільтоном Смітом, які отримали Нобелівську премію з медицини за своє відкриття. Їх назва, як правило, походить від організму, де вони вперше спостерігаються.

Такі ферменти широко використовуються при розробці методів клонування ДНК та інших молекулярних біологічних та генно-інженерних стратегій. Їх специфічні характеристики розпізнавання послідовностей та можливість вирізати послідовності, близькі до сайтів розпізнавання, роблять їх потужними інструментами в генетичній експерименті.

Фрагменти, генеровані рестрикційними ферментами, які діяли на певну молекулу ДНК, можуть бути використані для відтворення «карти» вихідної молекули, використовуючи інформацію про сайти, де фермент розрізає ДНК.

Деякі рестрикційні ферменти можуть мати однаковий сайт розпізнавання на ДНК, але вони не обов'язково розрізають його таким же чином. Таким чином, існують ферменти, які розрізають залишені тупі кінці, і ферменти, що розрізають залишкові згуртовані кінці, які мають різні застосування в молекулярній біології.

В даний час існує сотні різних комерційно доступних рестрикційних ферментів, пропонованих різними комерційними будинками; Ці ферменти функціонують як "спеціальні" молекулярні ножиці для різних цілей.

Особливості

Рестрикційні ферменти виконують протилежну функцію полімераз, оскільки вони гідролізують або розривають ефірну зв’язок у фосфодіефірному зв’язку між сусідніми нуклеотидами ланцюга нуклеотидів.

У молекулярній біології та генній інженерії вони широко використовуються інструменти для побудови векторів експресії та клонування, а також для ідентифікації конкретних послідовностей. Вони також корисні для побудови рекомбінантних геномів і мають великий біотехнологічний потенціал.

Останні досягнення генної терапії дозволяють в даний час використовувати рестрикційні ферменти для введення конкретних генів у вектори, які є носіями для транспортування таких генів у живі клітини, і які, ймовірно, мають можливість вставляти в клітинний геном для виконання постійні зміни.

Механізм дії

Рестрикційні ферменти можуть каталізувати дводіапазонне розщеплення ДНК, хоча деякі здатні розпізнавати односмугові послідовності ДНК і навіть РНК. Різання відбувається після розпізнавання послідовностей.

Механізм дії полягає в гідролізі фосфодіефірної зв'язку між фосфатною групою та дезоксирибозою в скелеті кожної ланцюга ДНК. Багато ферментів здатні різати на тому самому місці, що і вони розпізнають, інші ж розрізають між 5 і 9 парами до або після нього.

Ці ферменти зазвичай розрізаються на 5 'кінці фосфатної групи, утворюючи фрагменти ДНК з 5' фосфорильним кінцем і 3 'кінцевим гідроксильним кінцем.

Оскільки білки не контактують з місцем розпізнавання в ДНК, вони повинні бути переміщені послідовно, поки конкретний сайт не буде досягнутий, можливо, за допомогою "ковзаючих" механізмів на ланцюжку ДНК.

Під час ферментативного розщеплення зв'язок фосфодіестера кожної з ланцюгів ДНК розміщується в межах одного з активних сайтів рестрикційних ферментів. Коли фермент залишає місце розпізнавання та розщеплення, це відбувається через неспецифічні перехідні асоціації.

Типи

В даний час відомо п'ять видів рестрикційних ферментів. Ось короткий опис кожного з них:

Рестриктази типу I

Ці ферменти - це великі пентамерні білки з трьома субодиницями, одна для рестрикції, одна для метилювання та одна для розпізнавання послідовностей у ДНК. Ці ендонуклеази є багатофункціональними білками, здатними каталізувати реакції рестрикції та модифікації, вони мають активність АТФази, а також топоізомеразу ДНК.

Ензими цього типу були першими виявленими ендонуклеазами, вони вперше були очищені у 1960-х роках і з тих пір були вивчені великою глибиною.

Ферменти типу I широко не використовуються як біотехнологічний інструмент, оскільки ділянка розщеплення може знаходитися на різній відстані до 1000 пар основ від місця розпізнавання, що робить їх ненадійними з точки зору експериментальної відтворюваності.

Рестрикційні ферменти типу II

Вони являють собою ферменти, що складаються з гомодимерів або тетрамерів, які розрізають ДНК у визначені місця довжиною від 4 до 8 bp. Ці місця розщеплення зазвичай паліндромні, тобто вони розпізнають послідовності, які читаються однаково в обох напрямках.

Багато бактерій рестрикції типу II у бактерій розрізають ДНК, коли вони визнають її чужорідний характер, оскільки вона не має типових модифікацій, які повинна мати власна ДНК.

Це найпростіші рестрикційні ферменти, оскільки для розпізнавання та розрізання послідовностей ДНК їм не потрібен інший кофактор, крім магнію (Mg +).

Точність рестрикційних ферментів типу II у розпізнаванні та різанні простих послідовностей у ДНК у точних положеннях робить їх одними з найбільш широко використовуваних та незамінних у більшості галузей молекулярної біології.

У межах групи рестрикційних ферментів типу II є кілька підкласів, класифікованих за певними властивостями, які є унікальними для кожного. Класифікація цих ферментів проводиться шляхом додавання букв алфавіту, від A до Z, що слідує за назвою ферменту.

Деякі з підкласів, які найбільш відомі своєю корисністю:

Підклас IIA

Вони є димерами різних субодиниць. Вони розпізнають асиметричні послідовності і використовуються як ідеальні попередники для генерації ріжучих ферментів.

Підклас IIB

Вони складаються з одного або декількох димерів і вирізають ДНК по обидва боки послідовності розпізнавання. Вони вирізали обидві нитки ДНК інтервалу пари основ перед місцем розпізнавання.

Підклас IIC

Ферменти цього типу є поліпептидами з функціями поділу та модифікації ланцюгів ДНК. Ці ферменти розрізають обидві нитки несиметрично.

Підклас IIE

Ферменти цього підкласу найбільш використовуються в генній інженерії. Вони мають каталітичну ділянку і, як правило, потребують алостеричного ефектора. Ці ферменти потребують взаємодії з двома копіями їх розпізнавальної послідовності для ефективного розщеплення. У межах цього підкласу знаходяться ферменти EcoRII та EcoRI.

Рестрикційні ферменти типу III

Ендонуклеази рестрикції типу III складаються лише з двох субодиниць, одна відповідає за розпізнавання та модифікацію ДНК, а інша відповідає за розщеплення послідовностей.

Ці ферменти потребують двох кофакторів для своєї функції: АТФ і магній. Рестрикційні ферменти цього типу мають два асиметричні місця розпізнавання, переміщують ДНК у залежності від АТФ і розрізають її між 20-30 bp поруч із сайтом розпізнавання.

Рестрикційні ферменти типу IV

Ферменти типу IV легко ідентифікувати, оскільки вони розрізають ДНК із позначками метилювання, вони складаються з декількох різних субодиниць, які відповідають за розпізнавання та вирізання послідовності ДНК. Ці ферменти використовують GTP та двовалентний магній як кофактори.

Конкретні місця розщеплення включають нуклеотидні ланцюги з метильованими або гідроксиметильованими цитозиновими залишками на одній або обох ланцюгах нуклеїнових кислот.

Рестриктази типу V

Ця класифікація групує ферменти типу CRISPER-Cas, які ідентифікують та вирізають специфічні послідовності ДНК від організмів, що вторглись. Ензими Cas використовують ланцюг синтезованої КРИСПЕР направляючої РНК для розпізнавання та нападу на організми, що вторглися.

Ферменти, класифіковані як тип V, є поліпептидами, структурованими за ферментами типу I, II та II. Вони можуть вирізати ділянки ДНК практично будь-якого організму і з широким діапазоном довжини. Їх гнучкість і простота використання роблять ці ферменти одним з найбільш широко використовуваних інструментів в генній інженерії сьогодні, поряд з ферментами типу II.

Приклади

Рестрикційні ферменти використовувались для виявлення поліморфізмів ДНК, особливо в популяційних генетичних дослідженнях та еволюційних дослідженнях з використанням мітохондріальної ДНК, щоб отримати інформацію про швидкості заміщення нуклеотидів.

В даний час вектори, які використовуються для трансформації бактерій для різних цілей, мають мультиклонізовані сайти, де знаходяться сайти розпізнавання для ферментів множинної рестрикції.

Серед цих ферментів найбільш популярними є EcoRI, II, III, IV і V, отримані та описані вперше від кишкової палички; HindIII від H. influenzae та BamHI від B. amyloliquefaciens.

Список літератури

1. Бікл, Техас і Крюгер, DH (1993). Біологія обмеження ДНК. Мікробіологічні огляди, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, & Horvath, P. (2007). CRISPR забезпечує здобуту стійкість проти вірусів у прокаріотів. Наука, 315 (березень), 1709–1713.
3. Гудселл, Д. (2002). Молекулярна перспектива: Ендонуклеази обмеження. Основи стовбурових клітин медицини раку, 20, 190–191.
4. Halford, SE (2001). Стрибки, стрибки та лупінг обмежувальними ферментами. Біохімічне суспільство, 29, 363-373.
5. Єльтш, А. (2003). Підтримка ідентичності виду та контроль специфікації бактерій: нова функція для систем обмеження / модифікації? Гена, 317, 13-16.
6. Кребс, Дж., Голдштейн, Е., і Кілпатрік, С. (2018). Гени Левіна XII (12 ред.). Берлінгтон, Массачусетс: Джонс і Бартлетт.
7. Лі, Ю., Пан, С., Чжан, Й., Рен, М., Фен, М., Пенг, Н.,… Вона, Q. (2015). Використовуючи системи CRISPR-Cas типу I і III типу для редагування геномів. Дослідження нуклеїнових кислот, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Рестрикційні ферменти типу I та їх родичі. Дослідження нуклеїнових кислот, 1–25.
9. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Обмеження Ендонуклеази в аналізі та перебудові молекул ДНК. Ану. Преподобний Біохім. , 273–293.
10. Nei, M., & Tajima, F. (1981). ДНК поліморфізм, який можна виявити за допомогою рестрикційних ендонуклеаз. Генетика, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Клітинні та молекулярні науки Ендонуклеази рестрикції типу II: структура та механізм. Науки про клітинне та молекулярне життя CMLS, 62, 685–707.
12. Робертс, Р. (2005). Як рестрикційні ферменти стали робочими конями молекулярної біології. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Робертс, Дж. Дж. Та Мюррей, К. (1976). Обмеження ендонуклеаз. Критичні огляди з біохімії, (листопад), 123-164.
14. Стоддард, Б.Л. (2005). Структура та функція гомінгового ендонуклеази. Щоквартальні огляди біофізики, 1–47.
15. Tock, MR, & Dryden, DTF (2005). Біологія обмеження та антирестрикції. Сучасна думка з мікробіології, 8, 466–472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16. Wilson, GG, & Murray, NE (1991). Системи обмеження та модифікації. Ану. Преподобний Генет. , 25, 585-627.
17. Wu, Z., & Mou, K. (2016). Геномні уявлення про вірулентність Campylobacter jejuni та популяційну генетику. Інфекція. Дис. Переклад. Мед., 2 (3), 109–119.
18. Юань, Р. (1981). Структура та механізм багатофункціональних обмежувальних ендонуклеаз. Ану. Преподобний Біохім. , 50, 285-315.