БАКТЕРІАЛЬНИЙ МАЗОК: ХАРАКТЕРИСТИКИ ТА ПРЕПАРАТ - БІОЛОГІЯ - 2025

Бактеріального мазка є тонку плівку мазок з суспензії бактеріальних мікроорганізмів , який зроблений на прозорій скляній пластині або слайд, для спостереження під світловим мікроскопом.

Подовження у вигляді плівки проводиться для того, щоб максимально відокремити мікроорганізми, оскільки якщо вони згруповані, спостереження не зрозуміло.

Малюнок 1. Бактеріальний мазок, виявлений під скануючим електронним мікроскопом. Джерело: pixbay.com

При вивченні бактеріальних культур використовуються методи підготовки мазка, фіксації та фарбування для їх кращого аналізу. Через малі розміри мікроорганізмів обов’язково потрібно використовувати оптичний мікроскоп для їх спостереження.

Оптичні мікроскопи - важливі інструменти для спостереження за мазками. Вони використовують оптичні лінзи та світло, що дозволяють переглядати зразки з великим збільшенням.

Взагалі живі клітини не мають в основному кольорових структур, видно за допомогою світлового мікроскопа вони безбарвні, прозорі зразки, і вони виявляють дуже мало внутрішнього контрасту і з навколишнім середовищем.

Спостереження за допомогою простого мікроскопа яскравого поля без використання допоміжних методів фарбування дуже обмежене і застосовується лише в деяких випадках, наприклад, при спостереженні за рухом мікроорганізмів.

Для оптимального спостереження за мікроорганізмами необхідно забезпечити баланс між контрастом і роздільною здатністю. Деталі клітини не можна побачити під мікроскопом, навіть з високою роздільною здатністю; Використання барвників потрібно за допомогою фарбування технік, які забезпечують контраст для спостереження.

Характеристики бактеріальної мазки хорошої якості

Відмінний контраст

Для досягнення відмінного контрасту існують складні мікроскопи, які називаються фазовими контрастними мікроскопами, диференційними інтерференційними мікроскопами та мікроскопами темного поля. Цей тип мікроскопа використовується для спостереження за бактеріальними структурами, такими як оболонки та нитки, серед інших.

Фарбування - це проста техніка збільшення контрасту, що досягається за допомогою яскравого поліскопа. У цій техніці можуть використовуватися різні плями, які значно покращують мікроскопічне спостереження.

Фарбування здійснюють безпосередньо на мазках або розширеннях суспензій мікроорганізмів на предметних слайдах, попередньо висушених і закріплених.

Гарне виправлення

Фіксація - це техніка, що використовується для збереження клітинних структур; викликає інактивацію мікроорганізмів і адгезію до скла скло. Існують різні способи фіксації: фіксація тепла та хімічна фіксація.

Фіксація тепла

Це найбільш широко застосовуваний метод спостереження за бактеріальними мазками. Методика полягає у пропусканні бактеріальної суспензії мазка через полум’я запальнички. Ця методика здатна зберегти зовнішню морфологію бактерій, але руйнує їх внутрішні структури.

Хімічна фіксація

Для хімічної фіксації використовують хімічні речовини для консервації, такі як формальдегід або формалін, етанол та оцтова кислота. Перевага використання хімічних закріплюючих речовин полягає в тому, що досягається збереження внутрішніх клітинних структур мікроорганізмів.

Малюнок 2. Мазок крові. Джерело: Bobjgalindo, з Wikimedia Commons

Гарне фарбування

Найбільш поширені процедури фарбування раніше висушеного та фіксованого мазка - це позитивне або просте фарбування, диференційне фарбування та негативне фарбування. Існують також спеціальні прийоми фарбування певних клітинних структур (капсули, спори, джгутики).

Позитивне фарбування або просте фарбування

Позитивне або просте фарбування - це найбільш широко застосовувана техніка фарбування мазка. Тут використовуються барвники, які мають здатність зв’язуватися з певними мікробними структурами, дозволяючи спостерігати їх під мікроскопом.

Ці барвники мають у своїй хімічній структурі хромофорні групи (кольорова частина), з чергуванням подвійних зв’язків та одинарних зв’язків (кон'югації). Ці зв’язки можуть, у свою чергу, встановлювати іонні або ковалентні зв’язки з деякими клітинними структурами.

Барвники, використовувані при позитивному або простому фарбуванні, - це переважно хімічні похідні аніліну (кольорові органічні солі).

З іншого боку, серед барвників можна знайти деякі з основним рН, а інші з кислим pH.

Основні барвники

У основних барвниках хромофорна група має позитивний електричний заряд. Переважна більшість прокаріотичних мікроорганізмів має нейтральний внутрішній pH, і поверхня їх клітин заряджається негативно. Завдяки цій електростатичній взаємодії хромофор зв’язується з клітиною і забарвлює її.

Прикладами основних барвників є метиленовий синій, кришталево-фіолетовий, малахітовий зелений, основний фусцин, сафранін, серед інших.

Кислотні барвники

У кислотних барвниках хромофорна група має негативний електричний заряд. Вони використовуються для фарбування білків із позитивно зарядженими аміногрупами. Прикладами кислотних барвників є кислотний фусцин, бенгальська троянда, червоне Конго та еозин.

Диференційне фарбування

Техніка диференціального фарбування полягає у нанесенні двох барвників різного кольору чи інтенсивності для виділення різних мікроорганізмів під мікроскопом. Пляма по Граму та кислотно-спиртостійка пляма - найчастіше використовувані диференціальні плями в бактеріології.

Пляма за Грамом використовується як попередній тест, щоб знати форму, розмір, групування клітин, а також тип клітинної стінки. Використовуючи тест на забарвлення по Граму, бактерії клітинної стінки класифікують на грампозитивні та грамнегативні бактерії.

Негативне фарбування

У цій техніці використовуються хімічні барвники, які не проникають у внутрішню частину клітини, але роблять середовище, в якому мікроорганізми виявляються як чорний фон.

У техніці негативного фарбування мазок робиться краплею індійської фарби або суспензією нігрозину, яка після дозволу висихання при кімнатній температурі утворює непрозору плівку для проходження світла. Таким чином мікроорганізми виглядають як яскраві форми на темному тлі.

Підготовка

А. Мазок

1.- Помийте слайди дуже добре, висушіть папером, що всмоктується, і наклейте їх. На етикетці повинно бути зазначено зміст препарату, дата та ім’я особи, яка його обробила.

2.- Запаліть запальничку і стерилізуйте петлю щеплення в полум'ї до яскраво-червоного кольору.

3.- Дайте ручці охолонути.

4.- Візьміть пробірку для бактеріальної культури, зніміть ковпачок і швидко пропустіть гирло пробірки біля полум’я пальника (полум'я).

5.- Вставте петлю для щеплення в пробірку з культурою бактерій і відберіть пробу.

6.- Якщо культура знаходиться в рідкому середовищі, зразок, взятий з ручкою, помістіть у центр слайда і обережно розкладіть по колу діаметром приблизно 2 см.

7.- Стерилізуйте петлю щеплення ще раз.

8.- Дайте мазку висохнути на повітрі.

9.- Повторіть кроки 3 - 8 три рази.

10.- Якщо культура знаходиться в твердому середовищі, на гірку попередньо потрібно помістити краплю дистильованої води. Це робиться для змішування невеликого зразка культури, взятої з петлею щеплення, як зазначено в кроках 2 - 5 (асептичні умови).

11.- Розведіть розведений зразок краплею води на предметне скло і повторіть три рази.

В. Фіксація

1.- Додайте дві краплі метанолу або абсолютного етанолу в сухі мазки - з культур у рідкому середовищі -.

2.- Дозвольте висушувати повітря від запальнички.

3.- Якщо мазок походить з культури в твердому середовищі, сухий мазок фіксується теплом, пропускаючи його 2 - 3 рази швидко через найгарячішу частину запалення полум'я.

4.- Торкніться нижньої частини мазка спинною частиною лівої руки (для правшів; в іншому випадку користуйтеся правою рукою) і переконайтесь, що холодно.

C. Просте фарбування

1.- Додайте в мазок 2 краплі вибраної плями і залиште діяти протягом часу, необхідного в конкретних протоколах для кожної плями (як правило, від 1 до 5 хвилин).

2.- Деякі плями вимагають використання тепла для їх активації, і в цьому випадку потрібно бути дуже обережними при нагріванні гірки в запальнику (маніпулювати нею пінцетом і уникати закипання). Перегрівання мазка може знищити спостережувані клітини.

3.- Видаліть зайвий барвник, промивши дистильованою водою з пікету. Видаліть воду для промивання, обережно постукуючи гіркою по її краю, нахиленій на робочому столі.

4.- Дозвольте висушити повітря.

5.- Залежно від типу спостереження, на даному етапі використовується накривна кришка чи ні. Покривало захищає і зберігає мазок. Якщо на цьому етапі проводиться спостереження занурення масла, не використовуються покривні накладки, але мазок не може бути збережений.

D. остаточне збереження мазка

1.- Занурюйте мазок послідовно у кожен із зазначених нижче розчинів, як мінімум на 5 хвилин. Мета цих «ванн» - повністю зневоднити мазок. Кожен реагент слід ретельно злити перед тим, як вводити мазок в наступну ванну.

Порядок зневоднення ванн такий:

1. Етанол 70%
2. Етанол 95%
3. Чистий ацетон
4. Ацетон -ксилол 1: 1 суміш
5. Ксилол

Потім дайте висохнути на повітрі.

2. Монтуйте покривала, бажано 22 × 22 мм, використовуючи бальзам Канади або інший монтажний засіб.

Список літератури

1. Бріггс, Г. (1965). Причинно-наслідкові фактори в мікробіологічних лабораторних аваріях та інфекціях. Біологічні лабораторії армії США. Форт Детрік.
2. Cappucino, JG і Welch, CT (2017). Мікробіологія: лабораторний посібник. Пірсон.
3. Холт, редактор JG. (1977). Більш короткий посібник Бергей з детермінативної бактеріології. 8- ^й Балтімор: Вільямс і Вілкінс Ко
4. Johnson, TR та Case; CL (2018). Лабораторні експерименти з мікробіології. Пірсон.
5. Тілле, П. (2017). Діагностична мікробіологія. 14- ^й Сент-Луїс, США: Elsiever, Inc.