ПЛЯМА ВІД GIEMSA: ОБГРУНТУВАННЯ, МАТЕРІАЛИ, ТЕХНІКА ТА ВИКОРИСТАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Барвник Гімза є тип забарвлення клінічних зразків, на основі суміші кислот і основних барвників. Його створення було натхнене роботою Романовського, де Густав Гімса, хімік та бактеріолог, родом з Німеччини, удосконалив її, додавши гліцерин для стабілізації сполук.

Зміни, породжені в оригінальній техніці Романовського, дозволили значно покращити мікроскопічні спостереження, тому техніку хрестили з назвою пляма Гімса.

Різні зразки, забарвлені плямою Giemsa. A. Trypanosoma evansi в периферичній крові. B. Нормальні клітини крові. C. Borrelia theileri в периферичній крові. Лімфома Д. Беркітта.

Оскільки це проста технологія виконання, високофункціональна та економічна, вона в даний час широко використовується в клінічній лабораторії для гематологічних мазків, зразків кісткового мозку та тканинних відділів.

Техніка фарбування Giemsa дуже корисна для цитологічних досліджень, оскільки дозволяє спостерігати конкретні клітинні структури. Ця методика забарвлює цитоплазми, ядра, ядра, вакуолі та гранули клітин, здатні розрізнити навіть дрібні сліди хроматину.

Крім того, можуть бути виявлені значні зміни розміру, форми або забарвлення ядра, де можна візуалізувати втрату зв’язку ядро-цитоплазма.

З іншого боку, це дозволяє виявити незрілі клітини в кістковому мозку та периферичній крові, що є важливим для діагностики таких серйозних захворювань, як лейкемія. Також можливо виявити гемопаразити, зайві та внутрішньоклітинні бактерії, грибки, серед інших.

У цитогенетиці він широко використовується, оскільки можна вивчити мітоз клітин.

Основи фарбування Гімзи

Барвники типу Романовського засновані на використанні контрасту між кислими та основними барвниками, щоб досягти фарбування відповідно основної та кислотної структур. Як видно, існує спорідненість кислих барвників до фарбування основних структур і навпаки.

Основним барвником, який використовується, є метиленовий синій та його окислені похідні (Azure A та Azure B), а кислотний барвник - еозин.

Кислотні структури клітин - це нуклеїнові кислоти, гранули сегментованих базофілів, серед іншого, тому вони будуть фарбуватися метиленовим синім.

У цьому ж сенсі основними структурами клітин є гемоглобін і деякі гранули, такі як ті, що містяться в сегментованих еозинофілах, серед інших; вони будуть забарвлені еозином.

З іншого боку, через те, що метиленовий синій та блакитний характер характеризуються тим, що є метахроматичними барвниками, вони можуть надавати різному відтінку різним структурам відповідно до навантаження поліаніонів, якими вони володіють.

Ось таким чином стратегічне поєднання основних та кислотних барвників вдається розробити широкий спектр кольорів, відповідно до біохімічних характеристик кожної структури, проходячи блідо-синім, темно-синім, бузковим та фіолетовим відтінками у випадку кислотних структур.

У той час як забарвлення, що надається еозином, більш стійке, створюючи кольори між червонувато-оранжевим та лососевим.

матеріали

Матеріали для приготування вихідного розчину

Для приготування вихідного розчину потрібно зважувати 600 мг порошкоподібної плями Giemsa, вимірюючи 500 кубічних метилового спирту, що не містить ацетон і 50 кубічних кількостей нейтрального гліцерину.

Як приготувати основний розчин

Помістіть важкий порошок Giemsa в ступку. Якщо є грудочки, їх слід обприскати. Згодом додайте помітну кількість вимірюваного гліцерину і дуже добре перемішайте. Отриману суміш виливають у дуже чисту пляшку з бурштином.

Решту гліцерину поміщають у ступку. Ще раз перемішайте, щоб очистити решту барвника, який прилип до стінок ступки, і вилийте в ту саму банку.

Пляшку закривають кришкою і поміщають на водяну баню при 55ºC на 2 години. Поки вона знаходиться на водяній бані, обережно струшуйте суміш кожні півгодини.

Згодом суміші дають охолонути, щоб помістити спирт. Попередньо частина виміряного спирту поміщають у ступку для закінчення промивання залишкового барвника, а потім його додають у суміш разом із рештою спирту.

Цей препарат слід залишити дозрівати не менше 2 тижнів. Використовувану частину основного розчину слід процідити.

Щоб уникнути забруднення препарату, рекомендується перенести ту порцію, яка буде постійно користуватися, у невелику бурштинову пляшку з крапельницею. Заправляйте щоразу, коли реагент закінчиться.

Матеріали для приготування буферного розчину

З іншого боку, буферний розчин при рН 7,2 готують наступним чином:

6,77 г фосфату натрію (безводного) (NaHPO ₄ ), 2,59 г дигідрофосфату калію (KH ₂ PO ₄ ) та дистильовану воду зважують до 1000 куб.

Заключна підготовка барвника

Для приготування кінцевого фарбувального розчину вимірюють 2 мл відфільтрованого вихідного розчину і змішують з 6 мл буферного розчину. Перемішайте суміш.

Відповідним фактом, який слід враховувати, є те, що методи підготовки фарбувань можуть змінюватися залежно від комерційної компанії.

Додаткові матеріали, необхідні для виконання фарбування

Крім описаних матеріалів, у вас повинні бути мостики для фарбування, футболки з водою або буфером для прання, предметні гірки або чохли для предметів, секундомір для контролю часу фарбування та промокання паперу або якогось матеріалу, який можна використовувати для висихання ( марля або бавовна).

Техніка

Процес фарбування

1) Перед фарбуванням мазок зразка повинен бути готовий на чисту гірку.

Зразками можуть бути кров, кістковий мозок, гістологічні зрізи тканин або цервіко-вагінальні зразки. Рекомендується, щоб спреди були тонкими і мали 1 або 2 години висихання перед фарбуванням.

2) На мосту для фарбування розмістіть усі аркуші, які мають бути пофарбовані. Ви завжди працюєте в одному порядку, і кожен аркуш добре ідентифікований.

3) Помістіть на мазок кілька крапель 100% метилового спирту (метанол) і дайте йому діяти від 3 до 5 хвилин для фіксації та зневоднення зразка.

4) Відкиньте метанол, присутній на аркуші, і дайте йому висохнути на повітрі.

5) Після висихання кінцевий розчин фарбування покладіть крапельницею, поки весь лист не покриється. Залиште діяти 15 хвилин. Деякі автори рекомендують до 25 хв. Це залежить від ділового будинку.

6) Злийте пляму і промийте мазок дистильованою водою або 7,2 буферним розчином.

7) На промокальному папері дайте аркушам висохнути на відкритому повітрі, розташованих вертикально за допомогою підставки.

8) Очистіть тильну сторону гірки спиртовим тампоном або ватним тампоном, щоб видалити будь-які сліди плям.

Комунальні послуги

Техніка фарбування Giemsa застосовується в різних областях, включаючи: гематологію, мікологію, бактеріологію, паразитологію, цитологію та цитогенетику.

Гематологія

Це найчастіше використання цього плями. З його допомогою можна ідентифікувати кожну клітину, наявну в зразках кісткового мозку або периферичної крові. А також оцінка кількості кожної серії, можливість виявити лейкоцитоз або лейкопенію, тромбоцитопенію тощо.

Оскільки він чутливий при виявленні незрілих клітин, він актуальний при діагностиці гострих або хронічних лейкемій. Можна також поставити діагноз анемії, наприклад, серповидноклітинна анемія, серпоподібна клітина серед інших.

Мікологія

У цій області його використання звичайне для пошуку Histoplasma capsulatum (внутрішньоклітинний диморфний грибок) у зразках тканин.

Бактеріологія

У гематологічних мазках, пофарбованих Giemsa, можна виявити Borrelias sp у пацієнтів, які перенесли захворювання, що називається рецидивуючим лихоманкою. Спирохети рясні серед еритроцитів, у зразках, взятих у пік лихоманки.

Також можливо візуалізувати внутрішньоклітинні бактерії, такі як Rickettsia sp і Chlamydia trachomatis в заражених клітинах.

паразитологія

У галузі паразитології фарбування Giemsa дозволило діагностувати паразитарні захворювання, такі як малярія, хвороба Шагаса та лейшманіоз.

У перших двох паразити Plasmodium sp та Trypanosoma cruzi відповідно можна побачити в периферичній крові заражених пацієнтів, їх можна виявити на різних стадіях залежно від стадії захворювання.

Щоб покращити пошук паразитів у крові, рекомендується використовувати пляму Giemsa, змішану з плямою травень-Грюнвальд.

Аналогічно, шкірний лейшманіоз можна діагностувати, оцінюючи зразки біопсії шкіри, пофарбованої Гімсою, де виявлений паразит.

Цитологія

Фарбування Giemsa також використовується для цитологічного дослідження ендоцервикальних проб, хоча це не найчастіше застосовувана для цього методика.

Але у випадках дефіциту ресурсів його можна використовувати, маючи аналогічний функціонал, який пропонується технікою Папаніколау та за менших витрат. Однак це вимагає експертизи з боку екзаменатора.

Цитогенетика

Релевантною особливістю фарбування Giemsa є його здатність сильно зв'язуватися з багатими на аденін та тимін ділянками ДНК. Це дозволяє візуалізувати ДНК під час мітозу клітин, у різних конденсаційних станах.

Ці дослідження необхідні для виявлення хроматичних аберацій, таких як дублювання, делеції або транслокації різних областей хромосом.

Дослідження, що демонструють ефективність плями Giemsa

Cannova et al (2016) порівняли 3 методи фарбування для діагностики шкірного лейшманіозу.

Для цього вони використовували зразки, отримані від експериментальної тварини (Mesocrisetus auratus), експериментально прищепленої Leishmanias.

Автори продемонстрували, що пляма від Giemsa було краще, ніж пляма Pap-mart® та Gaffney. Тому вони вважали пляму Giemsa ідеальним для діагностики шкірного лейшманіозу.

Відмінні результати, отримані авторами, зумовлені тим, що комбінація барвників, що входять до складу суміші Giemsa, створює необхідні умови для створення сприятливого контрасту, що дозволяє чітко розмежувати структури амастиготи як внутрішньо, так і позаклітинно.

Інші методи (Pap-mart® та Gaffney) теж робили це, але слабкішим способом і тому складніше візуалізувати. Ось чому пляма Гімса рекомендується проводити при паразитологічній діагностиці лейшманіозу.

Аналогічно, дослідження Ramírez et al (1994) оцінило обґрунтованість плям Гімзи та Лендрума в кон'юнктивальних мазках для ідентифікації Chlamydia trachomatis.

Автори визначили, що плями від Giemsa та Ledrum мають однакову специфіку, але було виявлено, що Giemsa є більш чутливою.

Це пояснює, чому пляма від Giemsa в даний час найбільш часто використовується для діагностики хламідійних інфекцій, особливо якщо ресурсів мало.

Джерело: PanReac Applicationhem ITW Reagents. Пляма Giemsa. Версія 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Кастеллар-дель-Валле, Іспанія.

Рекомендації щодо хорошого фарбування

Висихання листів не слід прискорювати. Необхідно очікувати достатню кількість часу для його висихання на свіжому повітрі. Приблизно через 2 години.

Колір відразу через 2 години для найкращих результатів.

Щоб мазки краще закріпилися та пофарбувались, зразок необхідно розподілити на предметній ділянці таким чином, щоб залишався тонкий і рівномірний шар.

Кращим зразком крові є капіляр, оскільки мазок робиться безпосередньо з краплі крові, і тому зразок не містить ніяких добавок, що сприяє підтримці клітинних структур.

Однак якщо використовується венозна кров, ЕДТА слід застосовувати як антикоагулянт, а не гепарин, оскільки гепарин зазвичай деформує клітини.

Поширені помилки в фарбуванні Giemsa

У практиці цього забарвлення можуть бути допущені помилки. Про них свідчать різкі зміни тональності структур.

Надзвичайно синя забарвлення

Це може бути пов'язано з:

• Дуже густі мазки
• Перевищення часу фарбування
• Мити недостатньо.
• Використання реагентів значно вище нейтрального (лужного) рН.

За цих умов забарвлення наступних структур спотворюється таким чином, що еритроцити замість фарбування лососем-рожевими стануть зеленими, гранули еозинофілів, які повинні бути пофарбовані цегляно-червоним, стануть синюватими або сірими і так далі відхилення у звичних тонах.

Надмірно рожеве забарвлення

Це може бути пов'язано з:

• Недостатній час фарбування.
• Тривале або надмірне миття.
• Погане висихання.
• Використання висококислотних реагентів.

У цьому конкретному випадку структури, які зазвичай забарвлюються в синій колір, майже не видно, тоді як структури, які забарвлюються в рожевий колір, матимуть сильно перебільшені відтінки.

Приклад: еритроцити стануть яскраво-червоними або сильно-оранжевими, ядерний хроматин виявиться блідо-рожевим, а гранули еозинофілу забарвляться глибоко яскраво-червоним.

Наявність осадів у мазку

Причинами можуть бути:

• Використовуйте брудні або погано вимиті плівки.
• Не дайте мазку добре висохнути.
• Залишаючи фіксуючий розчин занадто довго.
• Недостатнє миття в кінці фарбування.
• Неадекватна фільтрація або відсутність фільтрації використовуваного барвника.

Наявність морфологічних артефактів

У мазках можуть з’являтися морфологічні артефакти, які ускладнюють візуалізацію та інтерпретацію наявних структур. Це пов’язано з:

• Тип використовуваних антикоагулянтів, таких як гепарин.
• Використання брудних, зіпсованих або жирних плівок.

Режим зберігання

Після приготування барвник повинен зберігатися при кімнатній температурі (15 - 25 ° C), щоб запобігти осіданню барвника. Її слід зберігати в щільно закритій бурштиновій ємності.

Список літератури

1. Cannova D, Brito E та Simons M. Оцінка методів фарбування для діагностики шкірного лейшманіозу. Салюс. 2016 рік; 20 (2): 24-29.
2. PanReac Applicationhem ITW Reagens. Пляма Giemsa. Версія 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Кастеллар-дель-Валле, Іспанія.
3. Кларк Г. Процедури фарбування (1981), 4т. Вільямс і Вілкінс.
4. Прикладна клінічна хімія. Пляма Giemsa для діагностики in vitro. Дистриб'ютор: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F та Grazioso C. Дійсність плям від Giemsa та Lendrum у кон'юнктивальних мазках для ідентифікації Chlamydia trachomatis. Бол Саніт Панам. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Казас-Рінкон Г. Загальна мікологія. 1994. Другий редактор Центрального університету Венесуели, бібліотечні видання. Каракас Венесуела.
7. "Пляма Гімзи". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 1 вересня 2017, 01:02 UTC. 6 грудня 2018 року, es.wikipedia.org.