БІУРЕТ: ОБГРУНТУВАННЯ, РЕАКТИВИ, ПРОЦЕДУРА, ВИКОРИСТАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Біурета є реагент , який використовується для визначення білка з довгим ланцюгом і коротким ланцюгом. Він особливо використовується в області аналітичної хімії та аналізу сечі для дослідження концентрації загальних білків у сироватці крові, плазмі та сечі.

Значення білка при певних патологіях може збільшуватися або зменшуватися. Симптоми гіпопротеїнемії зазвичай виникають у пацієнтів із захворюваннями нирок, у недоїдальних пацієнтів та у пацієнтів із хронічними інфекціями.

Хімічна структура комплексу, утвореного в реакції Біурета на позитивному тесті Біурета. Джерело: Yikrazuul / flickr

Хоча гіперпротеїнемія спостерігається при таких патологіях, як множинна мієлома, системний червоний вовчак, бактеріальний ендокардит, бактеріальний менінгіт, макроглобулінемія Вальденстрома, серед інших.

З іншого боку, наявність білка в сечі обумовлено фільтрацією альбуміну ниркою. Це патологічна поведінка, яку треба вивчити.

У цьому сенсі біурет дуже корисний, оскільки дозволяє кількісно оцінити наявність білків у сироватці, плазмі, сечі серед багатьох інших зразків.

Навіть Біурет може бути використаний для дослідження наявності та концентрації білків у погано досліджених зразках чи зразках невідомого складу. Тому він широко використовується в області досліджень.

Тест Біурета заснований на виявленні пептидних зв'язків. Випробування проводиться в лужному середовищі. Зразок повинен містити щонайменше дві пептидні зв’язки, щоб утворився фіолетово-фіолетовий комплекс. Комплекс утворюється об'єднанням зв’язків та іона міді.

Основа

Реагент Біуре складається з гідроксиду калію, сульфату кутрію та тартрату натрію та калію. Гідроксид натрію використовується для алкалізації середовища, оскільки ця умова є важливою для реакції.

Речовина, що реагує з білками, - сульфат куприку, тоді як тартарат натрію має функцію не допускати утворення гідроксиду міді, який має тенденцію до осадження та заважає реакції.

Якщо в пробі виявляються речовини з пептидними зв’язками (поліпептиди або білки), тест буде позитивним.

Реакцію трактують як позитивну, коли розчин стає фіолетовим. Колір виробляється утворенням комплексу між щонайменше двома пептидними зв’язками, які мають групу CO-NH та катіони куприку.

Фіолетовий комплекс може утворюватися двома способами: один - втратою протонів з амідних груп, що зв'язуються з металом (депронотація), а другий - об'єднанням вільних і зв'язуючих електронів кисню та азоту. з міддю.

Ця реакція може змінюватись за інтенсивністю та кольором залежно від типу білка.

Тест може бути виконаний якісно або кількісно. У якісній формі він повідомляється як позитивний чи негативний. Тоді як у кількісній формі концентрацію можна виміряти спектрофотометричним методом.

Реакція зчитується між 540-560 нм. Інтенсивність забарвлення прямо пропорційна концентрації пептидних зв’язків у зразку.

Реагенти

-20% гідроксид натрію (NaOH)

-Пентагідрат сульфату вуглецю 1% (CuSO _4. 5H ₂ O)

-Мішаний тетрагідрат натрію та калію (KNaC ₄ H ₄ O ₆ · 4H ₂ O)

Стабільність біуретового реагенту

-Ви повинні зберігатися в холодильнику.

Процес

Техніка

-Змістити 100 мкл зразка або стандарту для аналізу в пробірку.

-Додати 2 мл гідроксиду натрію.

-Дуже добре.

-Додати 5 мл реагенту Біуре.

-Змішайте і залиште відпочивати на 25 хвилин при кімнатній температурі, накрийте кришкою і захистіть від світла.

-Заспостерігайте за утворенням кольору чи ні, вимірюйте спектрофотометрично.

Калібрувальна крива

Альбумін сироватки великої рогатої худоби може використовуватися як стандарт для виконання калібрувальної кривої. З нього готують різні концентрації. Наприклад, 25, 50, 75, 100, 125 і 150%.

Реакцію встановлюють з усіма цими відомими концентраціями, і поглинання зчитується при довжині хвилі 540 нм. За даними відомих концентрацій та показань поглинання проводиться калібрувальна крива.

У кожному визначенні або партії оброблених зразків рекомендується монтувати стандарт. Альбумін бичачої сироватки 0,1-2 мг / мл може використовуватися як стандарт калібрування.

Вимірювання проводяться на спектрофотометрі при 540 нм.

Лінійність досягається до концентрації 12 г / дл.

Перешкоди

Речовини, що перешкоджають тестуванню Біурета

Хоча це не дуже часто, слід зазначити, що деякі речовини можуть втручатися під час виконання цього тесту. Наприклад, наявність аміаку може гальмувати утворення кольорів.

Так само інші речовини можуть поглинати на тій же довжині хвилі, як певні пігменти.

З іншого боку, інтерференція може бути створена, коли інша речовина, ніж пептидна зв'язок, утворює комплекс з куприковою сіллю. Приклад: деякі вуглеводи та певні ліпіди.

У випадку, якщо зразок, який аналізується, містить певний тип осаду, його слід процідити або центрифугувати перед монтажем випробування.

Речовини, які не заважають тесту Біуре

На тест не впливає наявність:

-Білірубін до концентрації 20 мг / дл.

-Гемоглобін до концентрації 750 мг / дл.

-Декстран до концентрації 30 г / л.

-Тригліцериди до концентрації 4000 мг / дл.

Перевага

-Це простий метод виконання.

-Це економічне випробування.

-У нього висока специфічність для білків.

-Невелике втручання.

Недоліки

Він має слабку чутливість до виявлення низької кількості білка. Робота, проведена Fuentes et al., Стверджує, що метод випробування Біурета має межу виявлення 1 мг / мл білка та межу кількісного визначення 3 мг / мл.

Однак інші дослідження, проведені в університеті Амазонії, відзначають значно нижчі значення. Межа виявлення, повідомлена дослідженням, становить 0,020 мг / мл, а межа кількісного визначення - 1,33 мг / мл.

Програми

Реагент або тест Біурета використовується для визначення білків у клінічних та неклінічних зразках в рутинних та науково-дослідних лабораторіях.

Патології, що виникають зі збільшенням або зменшенням

При багатьох патологіях важливо визначити концентрацію загальних білків у клінічних пробах, яка може бути підвищеною або зниженою.

Вони підвищені в:

-Множинна мієлома,

-Системний червоний вовчак,

-Бактеріальний ендокардит,

-Бактеріальний менінгіт,

Макроглобулінемія Вальденстрома, серед інших.

Він зменшується в:

- ниркова недостатність,

-Люди з важким ступенем недоїдання,

-Пациенти з хронічними інфекціями, серед інших.

Клінічні зразки

Найбільш поширені клінічні проби - сироватка, плазма та сеча. Нормальне значення білків у сироватці крові або плазмі становить 6,0-8,8 г / дл.

Концентрація білків у сечі у дорослих не перевищує показника 150 мг / 24 години.

Норма значення співвідношення білка сечі / креатиніну в сечі

Немовлята: <0,50 мг

Діти від 2 років: індекс: 0,20 мг

Дорослі: <0,2 мг

Неклінічні зразки

Реакцію Біуре можна використовувати для багатьох типів неклінічних зразків, таких як молочні продукти, антиактивне або будь-яке невідоме речовина, для якого потрібно дослідити наявність білків.

Список літератури

1. Вацкес Дж, Герра Л, Кінтана Дж, Рамірес Дж., Фернандо Р. Васкес Я. (2014). Фізико-хімічна характеристика та вміст білка в екстрактах рідини мангрової устриці (Crassostrearizophorae). Кубинський журнал хімії, 26 (1), 66-74. Отримано 26 червня 2019 року з http: //scielo.sld
2. Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J, Gil J. Функціональна характеристика мигдалю насіння манго (Mangifera indica L.) Revista Ciencia en Desarrollo. 2015 рік; 6 (1): 67-75
3. "Біурет". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 19 червня 2019, 16:37 UTC. 26 червня 2019, 22:18
4. Fuentes F, Quispe I, García J. Стандартизація методу Біуре для кількісного визначення загальних білків у багатовалентній антиботропній сироватці, виробленому в Національному центрі біологічних продуктів INS. Бол - Інст Нак Салюд 2012; 18 (11-12). Доступно за адресою: repositorio.ins.gob.pe
5. Лабораторії Вінера. Всього білків. Колориметричний метод визначення загальних білків у сироватці крові та плазмі. Доступно за адресою: wiener-lab.com.ar