ВІДВАР СЕЧОВИНИ: ОСНОВА, ПІДГОТОВКА ТА ЗАСТОСУВАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Бульйон сечовини являє собою рідка культуральна среда, використовується для виявлення присутності ферменту уреази в деяких мікроорганізмах. Уреаза - це мікробний фермент, який виробляється конститутивним способом, тобто синтезується незалежно від того, присутній субстрат, на який він діє.

Функція уреази пов'язана з розкладанням органічних сполук. Не всі мікроорганізми здатні синтезувати цей фермент, тому його визначення в лабораторії дозволяє виявити певні штами бактерій і навіть розмежувати види одного і того ж роду.

Негативний та позитивний тест на сечовину. Джерело: Фото зроблено автором MSc. Маріельса Гіл.

Існує два типи сечовини: Стюарт і Крістенсен. Вони відрізняються за складом і чутливістю. Перший - особливий, щоб показати велику кількість уреази, виробленої видами роду Proteus.

Другий є більш чутливим і може виявляти невелику кількість уреази, що утворюється пізно з інших бактеріальних родів, таких як Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter, Mycobacterium.

Бульйон сечовини Стюарта складається з сечовини, хлориду натрію, фосфату калію, фосфату монокалію, екстракту дріжджів, фенолу червоного та дистильованої води.

Тим часом, сечовий бульйон або агар Крістенсена складається з пептонів, хлориду натрію, монокалієвого фосфату, глюкози, сечовини, фенолу червоного, дистильованої води та агар-агару. Останнє лише в тому випадку, якщо це тверде середовище.

Основа

Фермент уреаза гідролізує сечовину з утворенням вуглекислого газу, води та двох молекул аміаку. Ці сполуки реагують, утворюючи кінцевий продукт, який називають карбонатом амонію.

Відвар сечовини Стюарта

Відвар карбаміду Стюарт більш буферний з рН 6,8. Тому мікроорганізм повинен бути здатний утворювати велику кількість аміаку, щоб стати фенолом червоним. РН повинен піднятися вище 8.

Тому бульйон сечовини Стюарт є вибірковим для видів Proteus, дає позитивні результати протягом 24 - 48 годин інкубації, і він не ефективний для бактерій, які виробляють малу кількість уреази або повільно гідролізують сечовину.

Це пояснюється тим, що види Proteus здатні використовувати сечовину як джерело азоту. Натомість інші бактерії, що виробляють уреазу, потребують додаткового джерела.

Однак Перес та ін. (2002) визначив, що бульйон сечовини Стюара був таким же ефективним, як агар сечовини Крістенсена при визначенні уреази у дріжджових штамах родів Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon і Saccharomyces.

Автори дослідження стверджують, що досягли 100% згоди з обома засобами масової інформації (Стюарт та Крістенсен) при інкубації протягом 24 та 48 годин; за винятком того, що штами, яким вдалося перетворити носій у сильний рожево-фуксійний колір, сприймалися як позитивні.

Це уточнення є необхідним, оскільки Лодер (1970) заявив, що майже всі дріжджі встигають перетворити скоси сечовини агару Крістенсена в блідо-рожевий. Це пов’язано з тим, що вони можуть гідролізувати сечовину в мінімальних кількостях, і утворенням амінів шляхом окисного декарбоксилювання амінокислот на поверхні. Це не слід сприймати як позитивне.

Агар або бульйон Крістенсена

Відвар сечовини або агар Крістенсена менш буферний, він здатний виявляти невеликі кількості аміаку. Крім того, це середовище збагачене пептонами та глюкозою. Ці сполуки змушують вирощувати інші мікроорганізми, що виробляють уреазу, які не ростуть у бульйоні Стюарт.

Аналогічно, тест сечовини Крістенсена пропонує більш швидкі результати, особливо для Proteus, завдяки чому можна отримати позитивні результати лише за 30 хвилин як мінімальний час і до 6 годин як максимальний час.

Решті мікроорганізмів, що продукують уреазу, вдається трохи змінити колір середовища через 6 годин, і сильно через 24, 48, 72 години і більше, і навіть деякі штами можуть давати слабкі реакції через 5 або 6 днів.

Інтерпретація обох засобів масової інформації (Стюарт та Крістенсен)

Засіб спочатку має жовто-оранжевий колір, і позитивна реакція перетворить колір середовища в рожево-фуксію. Інтенсивність забарвлення прямо пропорційна кількості виробленого аміаку.

Негативна реакція залишить середовище початкового кольору за винятком дріжджів, які можуть стати блідо-рожевими на середовищі агару Крістенсена.

Підготовка

Відвар сечовини Стюарта

Зважте необхідні грами за показаннями комерційної компанії. Розчиняють у переважно стерильній дистильованій воді. Не використовуйте тепло для розчинення, оскільки сечовина чутлива до тепла.

Мембранна фільтрація використовується для стерилізації. Для цього використовується фільтр Millipore з порами діаметром 0,45 мкм. Не використовуйте автоклав. Після того як розчин фільтрується, він розподіляється по стерильних пробірках. Для отримання достовірних результатів слід перевести мінімальну кількість 1,5 мл до максимальної кількості 3 мл на тубу.

Зберігайте в холодильнику і прогрівайте перед використанням.

Якщо метод фільтрації недоступний, середовище слід негайно використовувати для отримання надійних результатів.

Ще один спосіб приготування відвару Стюарта з сечовиною:

Деякі комерційні будинки продають базовий засіб для випробування на сечовину, не включаючи сечовину.

Кількість, вказана комерційною компанією, зважується. Його розчиняють у дистильованій воді і стерилізують в автоклаві при 121 ° С протягом 15 хвилин. Залишається трохи відпочити, і коли середовище прогріється, додайте 100 мл розчину сечовини, приготованої на 20% і стерилізуйте фільтруванням.

Він розподіляється в стерильних пробірках, як описано раніше.

Агар або бульйон Крістенсена

-Приготування розчину сечовини

Зважте 29 г зневодненої сечовини і розчиніть у 100 мл дистильованої води. Для стерилізації використовуйте метод фільтрації. Не автоклавуйте.

-Агарний базовий агар

Розчинити 24 г обезводненого базового агару в 950 мл дистильованої води. Стерилізуйте в автоклаві при 121 ° С протягом 15 хвилин. Дайте йому відпочити, поки не досягне температури 50 ° С і додайте попередньо підготовлену сечовину асептично.

Налийте 4-5 мл у стерильні пробірки і нахиліть до твердості. Повинен бути довгий дзьоб флейти.

Цей засіб також можна приготувати в рідкому вигляді.

Програми

Тест на сечовину надзвичайно ефективний для відрізнення роду Proteus від інших родів родини Enterobacteriaceae, враховуючи швидку реакцію, яку забезпечує Proteus.

Використовуючи композицію Крістенсена, тест допомагає розмежувати види одного роду. Наприклад, S. heemolyticus та S. warneri є коагулазонегативними та бетагемолітичними стафілококами, але відрізняються тим, що S. heemolyticus - сечовина негативна та S. warneri - сечовидна.

З іншого боку, McNulty успішно використовував 2% -ний відвар сечовини Крістенсена для дослідження наявності Helicobacter pylori у зразках біопсії, взятих із слизової шлунка (антральна область).

Про наявність H. pylori свідчить позитивний тест на сечовину. Тривалість спостереження за результатами прямо пропорційна кількості присутніх мікроорганізмів.

Як видно, це простий метод діагностики Helicobacter pylori при біопсіях шлунка.

Нарешті, цей тест також корисний для розмежування видів від родів Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus та Mycobacteria.

Посів сечового тесту

Обидва методи потребують сильного мікробного прищеплення для оптимізації результатів. Бактеріальні колонії переважно беруть із агару крові та дріжджів із агару Сабуро, за кількома винятками. Інокулум емульгується у рідкому середовищі.

Для відвару сечовини Стюарта інкубуйте при 37 ° С протягом 24 - 48 годин, знаючи, що ви шукаєте штами Протея лише тоді, коли штам є бактерією. Для дріжджів його можна інкубувати при 37 ° С або при кімнатній температурі протягом 24 - 48 годин інкубації.

У випадку з сечовинним відваром Крістенсена його інкубують при 37 ° С протягом 24 годин. Якщо тест негативний, його можна інкубувати до 6 днів. Якщо тест був позитивним до 6 годин, це вказує на те, що це штам роду Proteus.

У випадку з карбамідним агаром Крістенсена скоса агару сильно прищеплюється, не проколюючи. Відвар інкубують і інтерпретують так само.

QA

Для тестування середовища можуть використовуватися контрольні штами, такі як Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 та Salmonella typhimurium. Перші два мають дати позитивні результати, а останні два негативні.

Джерело: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. 5-е видання. Редакція Panamericana SA Аргентина.

Список літератури

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Використання відвару сечовини Стюарт для проби на уреазу, як тест при діагностиці дріжджів. Преподобний соц. Мікробіол. 2002; 22 (2): 136-140. Доступно за адресою: Scielo.org.
2. Мак Фаддін Дж. (2003). Біохімічні тести для виявлення бактерій клінічного значення. 3-е вид. Редакція Panamericana. Буенос-Айрес. Аргентина.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Мікробіологічна діагностика Бейлі та Скотта. 12 ред. Редакція Panamericana SA Аргентина.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. 5-е видання. Редакція Panamericana SA Аргентина.
5. Britannia Laboratories. Christensen Medium (агарова база сечовини) 2015. Доступний за адресою: britanialab.com