ЦИТОХІМІЯ: ІСТОРІЯ, ОБ’ЄКТ ДОСЛІДЖЕННЯ, КОРИСНІСТЬ І МЕТОДИ - БІОЛОГІЯ - 2025

Цитохімія включає в себе ряд методів , які засновані на ідентифікації і розташуванні конкретних речовин всередині клітини. Вважається галуззю клітинної біології, яка поєднує морфологію клітин з хімічною будовою.

За словами Бенслі, засновника застосування сучасної цитології, висловлюється, що мета цитохімії - виявити хімічну організацію клітин, щоб зрозуміти таємниці життя. А також вивчення динамічних змін, що відбуваються на різних функціональних етапах.

1: Додаткова хвороба Педжета. (Гематоксилін-Еозин) 2: старечі бляшки, що спостерігаються в корі головного мозку у пацієнта з хворобою Альцгеймера. (Срібна просочення) 3: Кроликовий язик, колагенові волокна (синій). М’язові волокна (фіолетові смужки). (Трихром Массона). 4: Печінкова тканина з жировою дегенерацією. (Судан III) 5: Запалена печінка. Некроз. (Толуїдин синій) Джерела: Вікіпедія. com / Користувач: KGH / Файли з загальнодоступним доступом / Mohit Lalwani

Таким чином можна визначити метаболічну роль, яку ці речовини відіграють у клітині.

Цитохімія використовує два основні методи. Перша заснована на хімічних та фізичних процедурах. Ці методи вдаються до використання мікроскопа як незамінного інструменту для візуалізації хімічних реакцій, що відбуваються на конкретні речовини всередині клітини.

Приклад: використання цитохімічних барвників, таких як реакція Фельгена або реакція PAS, серед інших.

Другий метод заснований на біохімії та мікрохімії. За допомогою цієї методології можна кількісно визначити наявність внутрішньоклітинних хімічних речовин.

Серед речовин, які можуть виявитись у тканинній або клітинній структурі, є такі: білки, нуклеїнові кислоти, полісахариди та ліпіди.

Історія цитохімії

Цитохімічні методи з часу їх винаходу допомогли зрозуміти склад клітин, і з часом з'явилося безліч методик, що використовують різні види барвників з різними спорідненостями та основами.

Згодом цитохімія відкрила нові горизонти із застосуванням певних субстратів, щоб показати колориметрично наявність ферментів або інших молекул всередині клітини.

Так само з'явилися й інші методи, такі як імуноцитохімія, яка мала велику допомогу в діагностиці багатьох захворювань. Імуноцитохімія заснована на реакціях антиген-антитіло.

З іншого боку, цитохімія також використовує флуоресцентні речовини, які називаються фторхромами, які є прекрасними маркерами для виявлення певних клітинних структур. Завдяки характеристикам фторхрому він виділяє структури, до яких він був прикріплений.

Що ти вивчаєш?

Різні цитохімічні методи, що застосовуються на біологічному зразку, мають щось спільне: вони виявляють наявність конкретного типу речовини та знають його розташування в оцінюваній біологічній структурі, будь то тип клітини чи тканина.

Ці речовини можуть бути ферментами, важкими металами, ліпідами, глікогеном та певними хімічними групами (альдегіди, тирозин тощо).

Інформація, що надається цими методиками, може дати керівництво не тільки для ідентифікації клітин, але і для діагностики різних патологій.

Наприклад, цитохімічні плями дуже корисні при розмежуванні різних видів лейкозів, оскільки одні клітини експресують певні ферменти або ключові речовини, а інші - ні.

З іншого боку, слід зазначити, що для можливості використання цитохімії необхідно враховувати наступні міркування:

1) Речовина має бути іммобілізовано в тому місці, де воно природним чином знаходиться.

2) Речовину слід ідентифікувати за допомогою субстратів, які реагують конкретно з нею, а не з іншими сполуками.

Корисність

Зразки, які можна вивчити за допомогою цитохімічних методів:

- розширена периферична кров.

- Розширений кістковий мозок.

- тканини, закріплені за гістохімічними методами.

- Клітини, фіксовані цитоцентрифугуванням.

Цитохімічні методи вкрай підтримують в галузі гематології, оскільки вони широко використовуються для допомоги в діагностиці та диференціюванні деяких видів лейкозів.

Наприклад: Естеразові реакції застосовуються для диференціації мієломоноцитарного лейкозу від гострого моноцитарного лейкемії.

Мазки кісткового мозку та периферичної крові у цих пацієнтів схожі, оскільки деякі клітини складно морфологічно визначити. Для цього проводиться тест на естеразу.

У першому специфічні естерази позитивні, тоді як у другому неспецифічні естерази позитивні.

Вони також дуже корисні в гістології, оскільки, наприклад, використання техніки фарбування важкими металами (просочення сріблом) забарвлює ретикулярні волокна інтенсивного коричневого кольору в тканині міокарда.

Методи цитохімії

Найбільш використовувані методи будуть пояснені нижче:

- Використання барвників

Використовувані плями в цитохімічних методах дуже різноманітні, і їх можна класифікувати за кількома точками зору:

За радикалом, до якого вони мають спорідненість

Вони поділяються на: кислі, основні або нейтральні. Вони є найпростішими і найбільш використовуваними за всю історію, дозволяючи нам відрізнити базофільні компоненти від ацидофільних. Приклад: фарбування гематоксилін-еозином.

У цьому випадку ядра клітин забарвлюються в синій колір (вони беруть гематоксилін, який є основним плямою), а цитоплазми - червоні (вони беруть еозин, який є кислотною плямою).

За кольором, який вони надають

Вони можуть бути ортохроматичними або метахроматичними. Ортохроматичні - це ті, які забарвлюють структури тим же кольором, що і барвник. Наприклад, випадок еозину, колір якого червоний, а плями червоний.

З іншого боку, метахроматика забарвлює структури, що відрізняються від їх кольору, наприклад, толуїдин, колір якого є блакитним, але все-таки плямами фіолетовим.

Життєві або суправітальні барвники

Вони нешкідливі барвники, тобто забарвлюють клітини і вони залишаються живими. Ці плями називаються життєво важливими (наприклад, трипановим синім кольором для фарбування макрофагів) або надрабітальним (наприклад, Янус зеленим для забарвлення мітохондрій або нейтральним червоним для окрашивания лізосомами).

- Виявлення ліпідів за допомогою жиророзчинних барвників

Тетроксид осмію

Він забарвлює ліпіди (ненасичені жирні кислоти) чорні. Цю реакцію можна спостерігати за допомогою світлового мікроскопа, але оскільки цей барвник має високу щільність, його також можна візуалізувати за допомогою електронного мікроскопа.

Судан III

Це одна з найбільш використовуваних. Цей барвник дифундує і солюбілізується в тканинах, накопичуючись всередині крапель ліпідів. Колір - червоно-червоний.

Суданська чорна пляма В

Він створює кращий контраст, ніж попередні, оскільки здатний розчинятися також у фосфоліпідах та холестерині. Це корисно для виявлення азурофільних та специфічних гранул зрілих гранулоцитів та їх попередників. Тому він виявляє мієлоїдні лейкози.

- фарбування альдегідною групою (періодична кислотна пляма Шиффа)

Плями періодичної кислоти Шиффа можуть виявляти три типи альдегідних груп. Вони є:

- Вільних альдегідів, природним чином присутніх у тканинах (плазмова реакція).

- Альдегіди, що утворюються селективним окисленням (реакція PAS).

- Альдегіди, що утворюються селективним гідролізом (реакція Фельгена).

PAS-реакція

Це фарбування засноване на виявленні певних видів вуглеводів, таких як глікоген. Періодична кислота Шиффа розриває СС-зв’язки вуглеводів завдяки окисленню гліколевих груп 1-2, вдається вивільнити альдегідні групи.

Вільні альдегідні групи реагують з реагентом Шиффа і утворюють фіолетово-червону сполуку. Поява фіолетово-червоного кольору свідчить про позитивну реакцію.

Цей тест є позитивним у рослинних клітинах, виявляючи крохмаль, целюлозу, геміцелюлозу та пептини. Перебуваючи в клітинах тварин, він виявляє муцини, мукопротеїни, гіалуронову кислоту та хітин.

Крім того, він корисний при діагностиці лімфобластних лейкозів або еритролейкемії, серед інших патологій мієлодиспластичного типу.

Що стосується кислих вуглеводів, пляма алкієва синя може бути використана. Тест є позитивним, якщо спостерігається світло-синій / бірюзовий колір.

Плазмова реакція

Реакція плазми виявляє наявність певних довголанцюгових аліфатичних альдегідів, таких як пальма та стеарал. Ця методика застосовується на заморожених гістологічних зрізах. Його обробляють безпосередньо реагентом Шиффа.

Фельгенова реакція

Ця методика виявляє наявність ДНК. Методика полягає у підданні нерухомої тканини гідролізу слабкої кислоти, щоб згодом реагувати на реагент Шиффа.

Гідроліз виявляє дезоксирибоза-альдегідні групи на дезоксирибозо-пуриновій зв'язці. Потім реагент Шиффа реагує з альдегідними групами, які залишилися вільними.

Ця реакція позитивна в ядрах і негативна в цитоплазмах клітин. Про позитивність свідчить наявність червоного кольору.

Якщо ця методика поєднується з метилом зеленого піроніну, можна одночасно виявити ДНК та РНК.

- Цитохімічні плями для білкових структур

Для цього може бути використана реакція Міллона, яка використовує ртутну селітру як реагент. Структури, що містять ароматичні амінокислоти, забарвляться червоно.

- Цитохімічні плями, які використовують субстрати, щоб показати наявність ферментів

Ці плями засновані на інкубації біологічного зразка з певним субстратом, а продукт реакції згодом вступає в реакцію з діазо-солями, утворюючи кольоровий комплекс.

Естерази

Ці ферменти присутні в лізосомах деяких клітин крові і здатні гідролізувати органічні ефіри, вивільняючи нафтол. Останній утворює нерозчинний азобарвник, коли він зв'язується з діазольною сіллю, фарбуючи місце, де відбувається реакція.

Існує кілька субстратів і залежно від того, який з них використовується, можна визначити специфічні естерази та неспецифічні естерази. Перші присутні в незрілих клітинах мієлоїдного ряду, а останні в клітинах моноцитарного походження.

Субстратом, що використовується для визначення специфічних естераз, є: хлороацетат нафтол-AS-D. Тоді як для визначення неспецифічних естераз можна використовувати декілька субстратів, таких як ацетат нафтолу AS-D, альфа нафтилацетат та альфа нафтил бутират.

В обох випадках клітини забарвлюються в темно-червоний колір, коли реакція буде позитивною.

Мієлопероксидаза

Цей фермент міститься в азурофільних гранулах гранулоцитарних клітин і моноцитах.

Її виявлення використовується для диференціації лейкозів мієлоїдного походження від лімфоїдних. Клітини, що містять мієлопероксидази, жовтіють жовто.

Фосфатази

Ці ферменти виділяють фосфорні кислоти з різних субстратів. Вони відрізняються один від одного залежно від специфіки субстрату, рН та дії інгібіторів та інактиваторів.

Серед найбільш відомих - фосфомоноестерази, які гідролізують прості ефіри (ПО). Приклад: лужна фосфатаза та кислотна фосфатаза, а також фосфамідази, які гідролізують зв’язки (PN). Вони використовуються для диференціації лімфопроліферативних синдромів та для діагностики волосисто-клітинного лейкемії.

- Трихромні забарвлення

Трихром Малларі-Азана

Вони корисні для диференціації цитоплазми клітин від волокон сполучної тканини. Клітини забарвлюються в червоний колір, а колагенові волокна сині.

Трихром Массона

Це має таку ж корисність, що і попередня, але в цьому випадку клітини забарвлюються в червоний колір, а колагенові волокна зеленіють.

- Барвники, які забарвлюють специфічні органели

Янус Грін

Це вибірково забарвлює мітохондрії.

Солі срібла та осмової кислоти

Забарвлює апарат Гольджі.

Толуїдин синій

Плями на тілах Ніссі

Солі срібла та PAS

Вони забарвлюють ретикулярні волокна та базальну пластину.

Орцеїн і фуксин резорцин

Вони фарбують еластичні волокна. З першим вони пофарбовані в коричневий колір, а з другим глибокий синій або фіолетовий.

- Інші методики, що застосовуються в цитохімії

Використання флуоресцентних речовин або фторхромів

Існують методи, які використовують флуоресцентні речовини для вивчення розташування структури в клітині. Ці реакції візуалізуються за допомогою спеціального мікроскопа під назвою флуоресценція. Приклад: методика IFI (непряма імунофлюоресценція).

Виявлення клітинних компонентів імуноцитохімією

Ці методи дуже корисні в медицині, оскільки допомагають виявити певну структуру клітин, а також кількісно її оцінити. Ця реакція заснована на реакції антиген-антитіло. Наприклад: методи ELISA (Enzyme Immuno Assay).

рекомендації

- Необхідно використовувати контрольні мазки, щоб оцінити хороші показники барвників.

- Свіжі мазки слід використовувати для цитохімічного фарбування. Якщо це неможливо, їх слід тримати захищеними від світла та зберігати при 4 ° C.

- Слід бути обережним, щоб використаний фіксатор не впливав негативно на досліджувану речовину. Іншими словами, слід запобігати можливості його витягання або гальмування.

- Потрібно дотримуватися часу використання фіксаторів, оскільки, як правило, він повинен тривати лише секунди, оскільки довгий вплив мазка на фіксатор може пошкодити деякі ферменти.

Список літератури

1. "Цитохімія". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 30 червня 2018, 17:34 UTC. 9 липня 2019, 02:53 Доступно на: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Методи металевого просочення для дослідження ретикулярних волокон міокарда: порівняльне дослідження. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Доступно за адресою: scielo.org
3. Сантана А, Лемес А, Боланьос Б, Парра А, Мартін М, Молеро Т. Цитохімія кислоти фосфатази: методологічні міркування. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89–92. Доступно за адресою: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Клітинна та молекулярна біологія. 11-е видання. Редакція Ateneo Буенос-Айрес, Аргентина.
5. Класичні інструменти для вивчення біології клітин. ТП 1 (додатковий матеріал) - Клітинна біологія. Доступно за адресою: dbbe.fcen.uba.ar