ДАПІ (4 ', 6-ДІАМІДИНО-2-ФЕНІЛІНДОЛ): ХАРАКТЕРИСТИКИ, ОБГРУНТУВАННЯ, ВИКОРИСТАННЯ - ХІМІЯ - 2025

DAPI (4 », 6-діамідинів-2-феніліндол) являє собою барвник флуоресцентним властивістю служить в маркер, який широко використовується в техніці флуоресцентної мікроскопії або потокової цитометрії, серед інших. Флуоресценція, яку вона випромінює, яскраво-синя, збудження відбувається між 455-461 нм (ультрафіолетове світло).

Барвник DAPI може з великою легкістю проходити через клітинну мембрану відмерлих клітин. Він також може забарвити ядра живих клітин, але в цьому випадку концентрація цього повинна бути вищою.

Хімічна структура флуоресцентного барвника DAPI. Джерело: Зображення: Файл: DAPI.svg - це векторна версія цього файлу. Його слід використовувати замість цього растрового зображення, коли він не поступається / Річард Вілер (Зефіріс) Відредаговане зображення

Барвник здатний отримати доступ до клітинної ДНК, до якої він має особливу спорідненість, з великою готовністю зв'язуючись з азотистими основами аденіну та тиміну. З цієї причини це дуже корисно в деяких методах молекулярної біології.

Ця сполука належить до групи барвників індолу і виявила більшу чутливість до ДНК, ніж до броміду етидію та йодиду пропіюму, особливо до агарозних гелів.

Застосування цього флуоресцентного барвника дуже широке, оскільки воно корисне для: вивчення змін ДНК в апоптотичних процесах (загибель клітин) і, отже, виявлення клітин у цьому процесі; для знімання фотографії ДНК (друк фотографій ДНК); вивчити бактеріальне зараження; або для візуалізації ядерної сегментації.

Він також використовувався при дослідженні хромосомних смуг, у виявленні Mycoplasmas sp ДНК, у взаємодії ДНК-білок, у фарбуванні та підрахунку клітин за допомогою імунофлуоресценції та навіть для фарбування зрілих пилкових зерен.

характеристики

DAPI - це абревіатура його хімічної назви (4 ', 6-діамідино-2-феніліндол). Його молекулярна формула - C ₁₆ H ₁₅ N _5. Має молекулярну масу 350,3. Поблизу діапазону ультрафіолетового світла (345 - 358 нм) відбувається максимальне збудження комплексу DAPI-ДНК, тоді як максимальне випромінювання флуоресценції відбувається між 455-461 нм.

Цей барвник характеризується як жовтий порошок, але структури, позначені цим фторофором, випромінюють блискуче синє світло.

Це сполука, розчинна у воді, однак для прискорення її розчинення можна подати деяку теплоту. Його можна розводити PBS, але не розчиняти в ньому безпосередньо.

Після того, як барвник підготовлений, його потрібно зберігати в темряві, тобто захищеному від світла, при температурі від 2 до 8 ° С (холодильник). За цих умов барвник стійкий більше 3 тижнів або місяців.

Якщо він захищений від світла, але залишений при кімнатній температурі, його стійкість падає до 2 або 3 тижнів, але піддається прямому освітленню, погіршення відбувається дуже швидко. Якщо ви хочете зберігати набагато довше, його можна охолодити при температурі -20 ° C, розподіленому в аликвотах.

Основа

Це фарбування засноване на генеруванні ядерного контрастного пляму в основних методах молекулярної біології, таких як: проточна цитометрія, флуоресцентна мікроскопія та фарбування метафазних хромосом або міжфазних ядер.

Ця методика заснована на великій спорідненості барвника до азотистих основ (аденіну та тиміну), що містяться в генетичному матеріалі (ДНК) в другорядній канавці. Перебуваючи на цитоплазматичному рівні, це залишає дуже мало фону.

Коли флуоресцентний барвник пов'язується з аденіновою та тиміновою областями ДНК, флуоресценція значно збільшується (у 20 разів). Колір, який він випромінює, яскраво-синій. Зокрема, не спостерігається випромінювання флуоресценції при зв'язуванні з парними базами GC (гуанін-цитозин).

Важливо зазначити, що, хоча він також має спорідненість до РНК, це не викликає проблем, оскільки найвищий ступінь випромінювання енергії з цієї молекули відбувається на іншій довжині хвилі (500 нм), на відміну від ДНК, що це робить у 460 нм. Крім того, збільшення флуоресценції, щойно пов'язана з РНК, становить лише 20%.

DAPI використовується більше для фарбування мертвих (нерухомих) клітин, ніж живих клітин, оскільки для фарбування останніх потрібна набагато більша концентрація барвника, це тому, що клітинна мембрана набагато менш проникна для DAPI, коли вона жива.

Барвник DAPI можна використовувати в поєднанні з червоними та зеленими флюорофорами для багатоколірного досвіду.

Використовуйте

DAPI (4 ', 6-діамідино-2-феніліндол) є відмінним флуорофором і тому широко застосовується в різних техніках і для різних цілей. Далі пояснюється використання DAPI в основних методах.

Проточна цитометрія

Дослідники Годе, Шуман та Занте у 1978 році вперше застосували та запропонували DAPI як флюорофор у проточній цитометрії, маючи великий успіх завдяки високій чутливості до ДНК та високій інтенсивності випромінювання флуоресценції.

Використання DAPI в цій методиці дозволяє вивчити клітинний цикл, кількісне визначення клітин та фарбування живих та мертвих клітин.

Хоча є й інші барвники, такі як бромід етидію, оксид Хоекста, акридин апельсин та йодид пропідію, ДАПІ є одним із найбільш широко використовуваних, оскільки він більш стійкий до фотостабільності, ніж ті, що згадувалися раніше.

Для цієї методики потрібно закріпити клітини, для цього можна використовувати абсолютний етанол або 4% параформальдегід. Зразок центрифугують, і супернатант відкидають, згодом клітини гідратрують додаванням 5 мл буфера PBS протягом 15 хвилин.

Поки йде час, підготуйте пляму DAPI за допомогою фарбуючого буфера (FOXP3 від BioLegend) в концентрації 3 мкМ.

Центрифугують зразок, відкидають супернатант і потім накривають 1 мл розчину DAPI протягом 15 хвилин при кімнатній температурі.

Віднесіть зразок на проточний цитометр відповідним лазером.

Проточна мікрофторометрія

Інша методика, в якій використовується DAPI, - це проточна мікрофторометрія разом з іншим фторофором, який називається мітраміцином. Обидва корисні для кількісної оцінки ДНК хлоропластів окремо, але DAPI найкраще підходить для вимірювання частинок бактеріофага Т4.

Гібридизація

Ця методика в основному використовує ДНК-зонди, позначені флуоресцентним барвником, який може бути DAPI.

Зразок потребує термічної обробки для денатурації дволанцюжкової ДНК та перетворення її на дві одноланцюгові ланцюги. Згодом він гібридизується з маркованим DAPI денатурованим ДНК-зондом, який має цікаву послідовність.

Пізніше його промивають, щоб усунути те, що не було гібридизовано, для візуалізації ДНК використовується контраст. Флуоресцентний мікроскоп дозволяє спостерігати гібридизований зонд.

Ця методика має на меті виявлення специфічних послідовностей у хромосомній ДНК, можливість встановити діагноз певних захворювань.

Ці цитомолекулярні методи допомогли визначити деталі при вивченні каріотипів. Наприклад, він показав багаті базовими парами ділянки аденозину та тиміну, звані гетерохроматичними областями або діапазонами DAPI.

Ця методика широко застосовується для дослідження хромосом і хроматину у рослин і тварин, а також при діагностиці пренатальних та гематологічних патологій у людини.

У цій техніці рекомендована концентрація ДАПІ становить 150 нг / мл протягом 15 хвилин.

Зібрані гірки слід зберігати захищеними від світла при температурі 2-8 ° C.

Імунофлуоресцентне фарбування

Клітини фіксують 4% параформальдегіду. Якщо потрібно використовувати інші плями, DAPI залишається в кінці у вигляді протистояння і клітини покриваються розчином PBS на 15 хвилин. Поки йде час, приготуйте розчин DAPI шляхом розведення PBS таким чином, щоб кінцева концентрація становила 300 мкМ.

Потім надлишок PBS видаляють і накривають DAPI протягом 5 хвилин. Миє кілька разів. Слайд переглядають під флуоресцентним мікроскопом під відповідним фільтром.

Лист безпеки

З цією сполукою слід поводитися обережно, оскільки це сполука, яка має мутагенні властивості. Активоване вугілля використовується для усунення цієї сполуки з водних розчинів, які слід викинути.

Рукавички, халат та захисні окуляри необхідно використовувати, щоб уникнути нещасних випадків із цим реагентом. Якщо трапляється контакт зі шкірою або слизовою, ділянку слід промити достатньою кількістю води.

Ніколи не слід пипетувати цей реагент ротом, використовуйте піпетки.

Не забруднюйте реагент мікробними агентами, оскільки це призведе до помилкових результатів.

Не розбавляйте пляму DAPI більше, ніж рекомендовано, оскільки це значно знизить якість плями.

Не піддавайте реагент прямому світлу і не зберігайте тепло, оскільки це зменшує флуоресценцію.

Список літератури

1. Brammer S, Toniazzo C та Poersch L. Corantes, які часто беруть участь у цитогенетиці рослин. Арк., Ін-т біол. 2015, 82. Доступно від: scielo.
2. Безсонні лабораторії. DAPI. Доступно за адресою: menarinidiagnostics.com/
3. Цитоцелюлярні лабораторії. 2019. Інструкція по застосуванню DAPI. доступний на сайті cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Поняття та методики в екології річок. (2009). Редакція Rubes, Іспанія. Доступно за адресою: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Використання флуоресценції в модифікованому дисекторному методі для оцінки кількості міоцитів у серцевій тканині. Арх Брас. Кардіол. 2012 рік; 98 (3): 252-258. Доступно від: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Наявність фітоплазми в папайї (Carica papaya) в Мексиці. Журнал Chapingo Серія садівництва, 2011; 17 (1), 47-50. Доступно за адресою: scielo.org.