КАТАЛАЗНИЙ ТЕСТ: ОБГРУНТУВАННЯ, МЕТОДИКА ТА ВИКОРИСТАННЯ - БІОЛОГІЯ - 2025

Тест на каталазу - це методологія, що використовується в бактеріологічних лабораторіях для виявлення присутності ферменту каталази в тих бактеріях, які ними володіють. Разом із плямою за Грамом вони є основними тестами, які слід провести на щойно виділених мікроорганізмах. Ці випробування спрямовують мікробіолога на кроки, які слід виконати для остаточної ідентифікації відповідного мікроорганізму.

В цілому бактерії, що містять цитохром, мають фермент каталазу, тобто аеробні та факультативні анаеробні бактерії повинні мати її. Однак є винятки, такі як стрептокок, який, незважаючи на факультативні анаеробні мікроорганізми, не володіє ферментом каталазою.

Запуск каталазного тесту, виявляючи позитивну реакцію. Джерело: Не надано машиночитаного автора. Nase припускається (на основі претензій щодо авторських прав).

Ось чому тест на каталазу використовується в першу чергу для розрізнення сімейства Staphylococaceae та Micrococaceae (обидві каталази позитивні) від родини Streptococaceae (негативні на каталази).

Так само рід Bacillus (каталаза позитивний) відрізняється від роду Clostridium (каталаза негативний), серед інших.

Основа

Каталаза - це фермент, класифікований як гідропероксидаза, це означає, що вони використовують як перекис водню (H ₂ O ₂ ).

Його також вважають оксидоредуктазою, оскільки в реакції, де вона бере участь, присутній елемент, який виконує роль донора електронів (відновлююча речовина), а інший як рецептор електронів (окислювальна речовина).

Каталаза - це білок, який містить прозаричну групу з чотирма тривалентними атомами заліза (Fe ⁺⁺⁺ ), тому є гомопротеїном. Під час реакції іон заліза залишається окисленим.

Можна сказати, що каталаза - це детоксикаційний фермент, оскільки її функція полягає у виведенні токсичних для бактерій речовин, що утворюються при метаболізмі бактерій. Серед цих речовин - перекис водню.

Перекис водню утворюється при розпаді цукрів аеробним шляхом. Цей процес відбувається наступним чином:

Суперроксид-іон (O ₂ ^- ) (вільний радикал) утворюється як кінцевий продукт засвоєння глюкози аеробним шляхом. Це токсично і усувається ферментом супероксиддисмутазою, який перетворює його в газоподібний кисень та перекис водню.

Перекис водню також токсична для бактерій, і її необхідно видалити. Фермент каталаза розщеплює перекис водню до води та кисню.

Каталаза може діяти на субстрати, крім перекису водню, такі як спирти, альдегіди, кислоти, ароматичні аміни та феноли. Однак перекис водню також може використовуватися каталазою для окислення інших токсичних сполук, таких як метиловий та етиловий спирт.

Так само каталаза присутня у фагоцитарних клітинах, захищаючи її від токсичної дії перекису водню.

Рутинна методика тесту на каталазу

-Слідз-метод

матеріали

3% перекис водню (10 об.).

Слайд мікроскопа

Одноразова пластмасова ручка або дерев'яна зубочистка.

Процес

Візьміть достатню кількість колонії для вивчення, не торкаючись агару, з якого вона прийшла. Колонія повинна бути свіжою, тобто з культури від 18 до 24 годин.

Помістіть колонію на суху гірку і додайте до неї краплю 3% перекису водню (також можна використовувати 30% H ₂ O ₂ ). Слідкуйте за тим, чи виділяються бульбашки чи ні.

Інтерпретація

Позитивна реакція: виділення газу, що засвідчується утворенням бульбашок (сильним барботажем).

Негативна реакція: відсутня утворення бульбашок.

-Прямий метод у чистій культурі

Помістіть 1 мл 3% H ₂ O ₂ на чисту пластину або клинову культуру, яка не містить крові (бажано поживного агару). Слідкуйте за тим, чи немає утворення бульбашок негайно. 30% H ₂ O ₂ також можна використовувати .

Він інтерпретується так само, як метод об'єкта porta.

-Метод з капілярною трубкою або Фунгом і Петришко

Наповніть капілярну трубку 67 мм на висоту 20 мм 3% перекисом водню за капілярністю.

Торкніться виділеної колонії, яку слід вивчити, з капіляром, наповненим 3% H ₂ O _{2 .} Поспостерігайте, якщо капіляр заповнюється бульбашками приблизно за 10 секунд. Цей спосіб дозволяє отримати напівкількість реакції в схрещуваннях:

Без хрестів немає бульбашок (негативна реакція).

+ ---- Мало пухирців (слабка або затримка реакції).

++ --– рясні бульбашки (помірна реакція).

+++ - бульбашки досягають протилежного кінця (сильна реакція).

-Тейлор і Аханзар для тестів каталази, які викликають сумніви

Помістіть ізольовану колонію на чисту суху гірку, потім помістіть краплю 0,5% H ₂ O ₂ і накрийте кришкою. Слідкуйте за тим, чи немає утворення вловлюваних бульбашок.

Інтерпретація: наявність бульбашок свідчить про позитивну реакцію. Ніяких бульбашок, це трактується як негативна реакція.

Каталазна проба на мікобактерії

Цю методику потрібно виконувати, контролюючи рН і температуру. Його потрібно проводити під кришкою ламінарного потоку, оскільки маніпуляції з різними видами мікобактерій небезпечні.

-Матеріали

Перекис водню 30% або 110 обсягів (супероксал).

Фосфатний буфер pH 7

10% Твін 80

Клінова культура мікобактерій протягом 3 - 4 тижнів

-Підготовка

Фосфатний буфер pH 7

Зважити:

1,336 г безводного фосфату монокалію (KH ₂ PO ₄ ).

1,420 г безводного динатрію (Na2HPO3) фосфату.

Розчиніть обидві солі в трохи стерильної дистильованої води і залийте водою до 1000 мл.

10% Твін 80

Зробіть розведення 1:10 в комерційно сконцентрованому Твін 80, щоб зробити це так:

Візьміть 1 мл Tween 80 і помістіть його в трохи дистильованої води, розчиніть, а потім доповніть об’єм водою до 10 мл.

Кінцевий реагент

Змішайте кількість фосфатного буфера з кількістю 10% Твін 80 (рівні частини). Визначте в лабораторії, скільки ви хочете підготувати.

-Процес

Помістіть 5 мл фосфатного буфера в стерильну пробірку (бакеліт).

За допомогою прищепного циклу візьміть достатню кількість колонок росту мікобактерій, посіяних в клинах, і розчиніть у фосфатному буфері.

Закрийте трубку, не затягуючи нитку. Помістіть на водяну баню при 68 ° C на 20 - 30 хвилин. Вийміть і дайте охолонути до 22-25 ° C

Відміряйте 0,5 мл кінцевого реагенту (суміші) і додайте його в пробірку з холодним розчином. Поспостерігайте за утворенням бульбашок чи ні.

Це трактується так само, як і попередні методики.

Використовуйте

Коли досягається зростання колонії в збагаченому середовищі, на отриманих колоніях слід проводити пляму по Граму та тест на каталазу. Це допоможе мікробіологу щодо процедур, які слід дотримуватися для остаточної ідентифікації.

Джерело: Підготовлено автором магістра. Маріельса гіл

QA

Для оцінки хороших показників реагенту перекису водню використовують свіжо культивовані контрольні штами, такі як золотистий стафілокок як позитивний контроль та штами Streptococcus sp як негативний контроль.

Іншою альтернативою, яка служить позитивним контролем, є розміщення краплі перекису водню на кров'яному агарі, еритроцити мають каталазу, отже, буде барботаж, якщо реагент у хорошому стані.

Шоколадний агар можна використовувати як негативний контроль, тут еритроцити вже лізіруються, а тест - негативний.

Обмеження

-Не використовуйте для тесту старих культур, оскільки це може спричинити помилкові негативи.

-Уникайте взяття колоній з культур на кров'яному агарі, якщо ви обережно не торкаєтесь агару; Ця процедура може призвести до помилкових позитивних результатів, оскільки еритроцити містять каталазу.

-Якщо ви берете колонію з платиновою ручкою, не змінюйте порядок процедури, оскільки це може призвести до помилкових позитивних результатів. Це відбувається тому, що платина здатна вступати в реакцію з перекисом водню, викликаючи барботаж.

-Не використовуйте реагент перекису водню, якщо він дуже старий, оскільки реагент дуже нестійкий і має тенденцію до руйнування з часом.

-Зберігайте реагент перекису водню, захищений від світла і охолоджений для запобігання пошкоджень.

-Контроль якості реагенту перекису водню кожного разу, коли він використовується.

-Урахуйте, що якщо використовується 30% H ₂ O ₂ , реакції сильніші, ніж реакції, що проводяться з 3% H ₂ O ₂ .

Список літератури

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. 5-е видання. Редакція Panamericana SA Аргентина.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Мікробіологічна діагностика Бейлі та Скотта. 12 ред. Редакція Panamericana SA Аргентина.
3. Мак Фаддін Дж. (2003). Біохімічні тести для виявлення бактерій клінічного значення. 3-е вид. Редакція Panamericana. Буенос-Айрес. Аргентина.
4. BD Laboratories. Реагент Каталаза-Готаріо. Доступно за адресою: http://winklerltda.cl
5. Vadequímica Laboratories. Перекис. Еквівалентність між обсягами та відсотками. Доступно за адресою: vadequimica.com